植物蛋白的糖基化修饰作为众多蛋白修饰中的一种类型,对于糖蛋白的功能发挥着不可或缺的作用。富含羟脯氨酸的蛋白（HCPs,hydroxyproline-containing proteins）中含有羟脯氨酸（O,Hyps,hydroxyprolines）,部分HCPs以O-连接的形式将糖基连接于Hyps位点上。迄今为止,关于HCPs的研究主要集中于富含羟脯氨酸的糖蛋白（HRGPs,hydroxyproline-containing proteins）中,包括:糖基化程度较高的阿拉伯半乳糖蛋白（AGPs,Arabinogalactan proteins）,糖基化程度适中的伸展蛋白（EXTs,Extensins）和糖基化程度较低的富含脯氨酸蛋白（PRPs,Proline-rich proteins）。其中异质化非常高的AGPs在高等植物不同生长发育时期都具有至关重要的作用。前人通过生物信息学方法在不同物种中鉴定了大量糖蛋白,但是关于其潜在糖基化修饰位点的鉴定却非常少。水稻（Oryza sativa L.）中有与拟南芥同源的5个ECA1-like蛋白,这类蛋白最初被鉴定为“非典型羟脯氨酸缺乏的AGPs”,其中3个蛋白在水稻双受精中具有重要作用,将其命名为“红线（HONGXIANs,HXs）”。HXs是从细胞中分泌到胞外的一类小肽蛋白,推测可能通过与受体相结合并将信号传递到目的蛋白而发挥功能。本文通过HCPs的鉴定,以HX1/2/3基因为研究对象,利用质谱技术、CRISPR/Cas9基因编辑技术、氨基酸序列比对、进化树分析、蛋白三维结构模建、子房整体染色透明、花粉管染色、显微共聚焦观察、定量PCR等生物信息学、细胞生物学、遗传学和分子生物学等研究手段,鉴定了水稻大量Hyps位点。同时,研究了Os HXs的生物学功能及调控机制,发现Os HXs对水稻双受精具有至关重要的作用。本文获得的主要研究结果如下:1.利用β-Glc Y试剂提取了不同组织和器官中的大量糖蛋白并去糖基,利用质谱技术鉴定了62个HCPs（hydroxyproline-containing proteins）。在62个HCPs中,鉴定出114个脯氨酸羟基化位点,并且O-连接的糖基化修饰可能通过羟基化的脯氨酸连接于这些糖蛋白的蛋白骨架上。同时,发现57个HCPs在水稻不同组织和器官中特异或优势表达,在雌蕊中HCPs数量为44个,其中41个是特异表达,比其它组织中获得的数量明显较多,这表明HCPs对于水稻雌蕊发育是至关重要的。2.通过对HCPs中Hyps位点的分析,发现糖蛋白簇AO,OA,OG,VO,LO,和OE位点显著富集,并且在这些糖蛋白簇中脯氨酸被羟基化。此外,AO和OA的糖蛋白簇在所有鉴定的糖蛋白中数量占比非常高,表明丙氨酸残基对脯氨酸的羟基化非常重要。进一步的分析发现AGPs中羟脯氨酸位点都位于类似AGPs的高PAST含量区域,表明AGPs中类似于AGPs的结构域是其糖基化的潜在区域。3.通过对不同AGPs基因表达研究,发现AGPs基因在水稻生长发育的各个时期均有不同程度的表达。并且筛选了6个基因在水稻花药中特异表达,这些基因对于花药发育和花粉管生长可能具有重要的作用,并能作为marker基因应用于水稻花药发育和双受精研究中。利用CRISPR/Cas9技术获得了突变体osfla15、osfla22、osfla25和osela3,但是,观察发现在水稻植株生长发育特别是花药发育过程中没有明显的表型缺陷,表明AGPs在水稻中可能存在功能冗余,需要进一步获得多基因突变体,并加以研究。4.通过氨基酸序列比对和系统进化树分析发现,属于ECA1-like类HXs蛋白在被子植物中保守存在。在最早的被子植物无油樟中,同样发现HXs同源蛋白的存在。进一步分析发现,在双子叶拟南芥中共有124个ECA1-like类蛋白,数量非常多,在同样是双子叶植物的苜蓿中只有17个;而在水稻中只有5个,其中3个经过进一步研究发现属于HXs蛋白,并且HX2和HX3蛋白更为同源。但是,进化树分析发现,在藻类、菌类和地衣类等低等植物以及苔藓和蕨类等高等植物中没有HXs的同源蛋白,暗示HXs是被子植物特有的蛋白,对于被子植物有性生殖的特征过程—双受精过程至关重要。5.通过CRISPR/Cas9技术,获得了水稻HXs不同基因组合的多个突变体,包括hx1、hx1/2、hx2/3、hx1/2/3。在这些突变体中,开花前的植株生长发育以及花粉和胚囊的发育均正常。但是,在hx1、hx1/2、hx1/2/3突变体中观察到成熟花穗败育现象具有明显的差异,结实率分别为63.80%、40.19%和5.21%。6.利用实时定量PCR和荧光共聚焦显微观察发现,Os HXs蛋白在生殖组织中的卵细胞中强烈表达,而在精细胞中不表达。更为有趣的是,与拟南芥HXs基因只在卵细胞中表达的情况不同,水稻HXs基因在15 DAG幼苗的叶片和根中也有高丰度表达,暗示在生物进化过程中,水稻HXs基因可能被赋予了新的功能。7.进一步研究显示,在水稻授粉后3.5 h的植株中,突变体hx1、hx1/2和hx1/2/3中部分胚囊不能受精,表明HXs通过影响水稻双受精从而导致花穗败育。在突变体hx2/3中没有明显的花穗败育,而在突变体hx1/2/3中几乎完全败育,这一现象也表明HX1是调节水稻双受精的主效基因,而HX2和HX3则起着辅助作用。8.采用曙红B透明染色,发现在水稻突变体hx1/2中授粉8 h和32 h后正常双受精胚囊比例分别为26.56%和36.19%,而最终的结实率为40.19%,比例有所差异,这表明授粉8 h后未受精的胚囊在其后的发育过程中可能再次受精。进一步通过孚尔根染色,发现8 h未受精的胚囊又重新启动吸引花粉管的“补救”机制,使另外的花粉管重新进入胚囊并释放第二对精细胞,促使部分未受精胚囊再次受精,推测这可能是HXs 3个基因同时突变的植株中也有小部分结实的原因。9.通过水稻突变体hx1/2的子房透明观察,发现其中有少部分的单一受精现象,即只有卵细胞受精或者只有中央细胞受精的现象,单一受精的比例约为5.62%。利用希夫试剂对突变体hx1/2的孚尔根染色观察,发现进入胚囊的两个精细胞都是成对存在且未分离。