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硫化叶菌Sulfolobus生活在酸热的极端环境下,其基因组DNA更容易受到损伤,但硫化叶菌基因组的突变率与温和环境中的生物相同,基因组仍然保持稳定,说明硫化叶菌具有高效的DNA损伤修复能力。古菌的遗传信息加工系统中的蛋白复合物较真核生物相对简单,是一个“简化版本”。利用古菌作为模型研究细胞对DNA的加工代谢,能够为了解复杂的真核生物DNA代谢机制提供参考。许多DNA的损伤可使行进的复制叉在损伤处停滞,细胞可以通过复制叉回退,经同源重组修复受损的DNA,重启停滞的复制叉。古菌Hjm （He1308 a）解旋酶参与同源重组修复途径,加工处理停滞的复制叉,回退形成修复过程中的重要中间产物Holliday junction结构。Hjm还具有链退火活性以及可能在Holliday junction迁移等过程中起重要作用。Hjm解旋酶的结构域V是一个酶活性调控结构域,该结构域的缺失以及其中保守精氨酸位点的突变导致酶活性的变化。然而,其体内功能以及结构域与功能的关联尚不明确。为了研究Hjm的体内功能,本研究首先以硫磺矿硫化叶菌Sulfolobus solfataricus的Hjm为模板,使用SWISS-MODEL同源建模得到冰岛硫化叶S.islandicus REY15A 中 Hjm的结构域构成。然后基于MID （marker insertion and target gene deletion）敲除策略,设计构建结构域敲除载体,筛选得到marker整合型菌株。在反选的条件下,通过突变体增殖实验发现结构域V对细胞生活是必需的。利用含有辛伐他汀抗性基因表达盒的pSSR表达载体构建成功hjm自身启动子的遗传回补系统,而阿拉伯糖启动子作为强启动子则不能实现回补。采用重叠延伸PCR技术构建点突变体以及结构域缺失突变体,利用遗传回补系统分析发现结构域V中与酶活性调控相关的精氨酸位点以及结构域Ⅲ中参与双链DNA识别结合的HTH （helix-turn-helix）基序对细胞生活都是必需的。另外,通过Western blot检测Hjm蛋白在体内的量,发现无论是回补细胞还是野生型细胞,即使经过UV、MMS （甲烷磺酸甲酯,Methyl methanesulfonate,对DNA造成烷基化损伤）损伤剂处理,Hjm蛋白在细胞内的表达量始终保持在本底水平。这些结果说明Hjm酶活性以及蛋白的表达在细胞内是受到严格调控的。Hjm是一类DExD/H-box解旋酶,DExD/H-box超家族是解旋酶最大的家族,广泛存在于三域生物中。它们属于超家族2解旋酶,在双链解旋、转录、翻译、mRNA前体加工和1nRNA降解等RNA或DNA代谢过程中起着重要作用,并且参与核糖体的生物合成以及核质运输。目前对于DExD/H-box解旋酶的研究主要集中在有限的几个酶的体外生化性质和结构解析等方面,众多的DExD/H-box解旋酶在体内参与的DNA代谢加工途径、确切的机制及在体内行使的功能还需要进一步研究。为了了解冰岛硫化叶菌DExD/H-box家族解旋酶的种类,分析基因必需性,探究在细胞内参与的途径和具体功能,我们首先通过生物信息学分析,确定冰岛硫化叶菌中共包含15个DExD/H-box解旋酶。然后使用marker置换方法,对其中8个尚未报道或者是研究很少的DExD/H-box解旋酶基因尝试敲除,分析必需性,得到△SiRe 0681和△SiRe 1605两个缺失突变体。由此说明这两个基因是非必需基因,其他6个可能是必需基因。以野生型REY15A作为对照,测定缺失突变体的生长曲线,发现在MMS损伤剂存在时,△SiRe 0681比同条件下的野生型生长更快,CFU（colony fomation unit）实验显示前者形成更多的克隆。比较转录组分析发现,经过MMS处理的△SiRe 0681与同条件下的野生型相比,前者与染色体分离相关的SiRe 1962和SiRe 1625分别上调至野生型的2.46和2.06倍；细胞分裂蛋白CdvB（SiRe1174）,CdvB2（SiRe 1200）和CdvB1（SiRe 1550）分别上调2.16,4.86和5.27倍.流式细胞分析发现△SiRe 0681具有更多的G2期细胞,G2期细胞增多使得△SiRe0681对MMS的抗性增强。以△SiRe0681作为受体细胞,使用pSSR载体构建得到SiRe0681自身启动子的回补菌株。将转入空载pSSR质粒的野生型REY15A作为对照,测定生长曲线、流式细胞分析,发现无论有或无MMS存在,两者在同等条件下的生长以及细胞周期无差异,SiRe 0681回补菌株能够恢复野生型的表型。我们认为SiRe 0681的敲除影响细胞周期,使得细胞越过了在G1/S期对DNA的非必需加工,从而加快了细胞的生长,使更多的细胞到达G2期。生长曲线和CFU的测定显示△SiRe 1605对MMS的敏感性增强。转录组分析表明,经MMS处理的△SiRe 1605与同条件下的野生型相比,一些核酸代谢蛋白以及DNA损伤修复蛋白,包括DNA聚合酶Ⅱ、Rad50和Mrell基因转录水平分别下调至野生型的0.22,0.45,0.45倍；另外,细胞分裂蛋白CdvA、CdvB、 Vps4、CdvB2、CdvB1和CdvB3基因转录水平分别下调至野生型的0.28,0.31,0.33,0.22,0.14,0.36倍。SiRe 1605作为一类Lhr （long helicase related protein）蛋白,可能通过调控DNA修复相关蛋白的转录从而参与DNA损伤的修复。