论文部分内容阅读
目的：帕金森病(Parkinsons disease，PD)是中老年人最常见的神经退行性疾病之一，发病率仅次于阿尔兹海默病。寻求一种方法调控小胶质细胞活性，阻断其持续活化的恶性循环，缓解对神经元的损伤是本课题的研究目的之一。探索miR-124对小胶质细胞分泌促炎因子的调控作用及可能的机制成为了本课题主要的研究目的。 P38α属于p38MAPK家族中的一员，p38MAPK通路主要与炎症反应、细胞生长、分化，细胞周期和坏死有关。迄今为止，已经发现的p38MAPK家族有p38α、p38β、p38γ和p38δ四个亚型，它们的编码基因、组织特异性和功能各不相同。P38α对小胶质细胞分泌促炎因子的过程必不可少，而小胶质细胞中p38α对LPS诱导的神经元变性也至关重要。生物信息学和体外实验的方法都预测p38α是miR-124的靶基因之一，而且p38α已被证实是miR-124的一个靶基因，在小脑颗粒细胞中，miR-124显著抑制p38α的表达，但在小胶质细胞中，miR-124对p38α的表达是否具有同样的调控作用还不得而知。 基于上述的研究和猜想，本课题首先研究了LPS刺激下BV-2细胞中miR-124的表达变化，然后通过转染miR-124mimics和inhibitor上调和降低BV-2细胞中miR-124的表达，研究miR-124对小胶质细胞活化和炎症因子释放的影响。随后，在进一步确定p38α是miR-124的一个靶基因后，引入p38α特异性抑制剂，进一步探究miR-124是否通过p38αMAPK通路调控了小胶质细胞的活化状态。最后，我们建立一个特殊共培养系统，将不同处理条件下培养BV-2细胞的上清液与新鲜培养基混合后作为条件培养基用于培养神经元细胞SH-SY5Y，以探究miR-124调控BV-2细胞的活性而产生的神经元保护作用。本研究成果丰富了PD发病炎性机制的理论基础，也为将来PD治疗提供了一个新的靶标。 方法:1.BV-2细胞和SHSY-5Y细胞的培养和处理 BV-2细胞培养于含10％胎牛血清和0.1％青-链霉素的DMEM培养基中。作用于BV-2细胞的LPS终浓度为0.1μg/ml。P38α抑制剂VX702终浓度为50rm。SH-SY5Y细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中。两种细胞都在37℃的5％ CO2培养箱中培养。 2.转染试验 将MiR-124模拟物(mimics)，miR-124抑制剂(inhibitor)及各自的对照物按照说明书操作规范，在转染试剂riboFECTTM CP作用下转染进入BV-2细胞。miRNA-124模拟物序列为:（5-CCGUAAGUGGCGCACGGAAU-3），miR-124抑制剂序列为（5-GGCAUUCACCGCGUGCCUUA-3）。模拟物和抑制剂的工作浓度分别为50nm和100nm。 3.RT-qPCR检测小胶质细胞中miR-124、TNF-α，IL-1β的mRNA表达TRIzol法提取总RNA。MiR-124的RT-qPCR采用特异性引物进行逆转录和扩增，内参选用U6 snRNA。普通基因的RT-qPCR采用随机引物逆转录后，再用特异性引物进行扩增并检测荧光值。小鼠GAPDH作为内参基因。基因表达的结果通过计算△△Ct值进行倍数比较。 4.ELISA检测培养基中TNF-α，IL-1β的含量 BV-2细胞(5×104)种植于24孔板中，12小时贴壁后进行miR-124模拟物或抑制剂的转染试验。转染24小时后加入LPS(100ng/ml)刺激12小时。上清液中TNF-α和IL-1β的浓度用ELISA试剂盒检测。 5.Western Blotting 用加有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制的RIPA裂解缓冲液裂解BV-2细胞，提取总蛋白。BCA法测定蛋白质含量，10％SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳，将蛋白半干转至PVDF膜上，封闭液封闭后，加入各种目的蛋白单克隆抗体和GAPDH小鼠单克隆抗体。之后用辣根过氧化物酶结合的二抗孵育，ECL法显影后扫描。 6.CCK-8实验检测SH-SY5Y细胞的存活率 将SH-SY5Y细胞(5×103)种植在96孔板中，孵育24小时贴壁后，更换条件培养基继续培养24小时。将CCK-8溶液加入孔中，37℃下孵育90分钟后在450nm波长下检测吸光度值。 7.流式细胞仪分析SH-SY5Y细胞的凋亡率 SH-SY5Y细胞(5×105)种板于6孔板，孵育24小时贴壁后更换条件培养基继续培养24小时，消化收集细胞后分别加入annexinⅤ-FITC和PI。室温下避光孵育15分钟，流式细胞仪检测凋亡细胞数。 8.统计学分析 统计描述采用均数±标准差（M±SD）的形式。统计分析采用单因素方差分析(ONE-WAYANOVE)(Tukeys test)和双尾Students t test。P＜0.05被认为是有统计学差异。 结果:1.BV-2细胞在LPS刺激活化后，miR-124表达降低。 设置不同浓度梯度的LPS（0.1，0.5 and1μg/ml）刺激BV-2细胞，24小时后，RT-qPCR检测各组miR-124的表达情况。结果显示:与空白对照组相比，BV-2细胞中miR-124在LPS刺激后下降，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，且呈浓度依赖性。在LPS（0.1μg/ml）刺激下，检测不同的作用时间点(1h，6h，12h和24h)miR-124表达量，结果显示:随着LPS作用时间的延长，BV-2细胞miR-124的表达量逐渐下降，在12h和24h差异显著(P＜0.05) 2.过表达miR-124能够抑制LPS诱导的小胶质细胞分泌促炎细胞因子，下调miR-124的表达使促炎细胞因子分泌增多。 将miR-124mimics和inhibitor分别转染进入BV-2细胞，24小时后，利用RT-qPCR检测miR-124表达量。结果发现:转染mimics组miR-124的表达量显著增加(P＜0.05)。而转染inhibitor组的miR-124表达量显著降低(P＜0.05)。然后，将miR-124mimics或inhibitor转染进入BV-2细胞24小时后加入LPS（0.1μg/ml），刺激12小时后分别用RT-qPCR和ELISA的方法检测TNF-α andIL-1β在mRNA和蛋白水平的表达量。结果发现:与阴性对照组相比，过表达miR-124后，TNF-α和IL-1β的表达显著降低(P＜0.05)，而转染miR-124inhibitor组TNF-α和IL-1β表达量较阴性对照组明显升高(P＜0.05)。 3.miR-124通过抑制p38α调控小胶质细胞分泌促炎因子。 采用TargetScan等在线靶点预测软件预测miR-124可能的靶基因。结果提示: p38α mRNA3UTR区存在与miR-124结合的位点。在BV-2细胞中转染miR-124mimics后，RT-qPCR和Western Blot检测p38α在mRNA和蛋白水平表达量的变化。结果显示:与阴性对照组相比，转染miR-124mimcs组p38α的表达量在mRNA和蛋白水平均显著下降(P＜0.05)。接下来，在BV-2细胞中转染miR-124mimics后，加入LPS（0.1μg/ml）刺激30min，Western Blot检测p38α、p-p38α、ERK、p-ERK等蛋白表达量的变化。结果显示:与阴性对照组相比，转染miR-124mimcs组p38α和p-p38α的蛋白表达显著下降(P＜0.05)，而ERK和p-ERK表达量没有差异(P＞0.05)。将BV-2细胞经p38α特异性抑制剂VX702预处理后，分别转染miR-124mimics或inhibitor，然后采用LPS(0.1μg/ml)刺激，结果发现:经VX702预处理后，miR-124mimics转染组与未转染组TNF-α和IL-1β的分泌量没有差异(P＞0.05)。miR-124inhibitor转染组与未转染组TNF-α和IL-1β的表达也没有差异(P＞0.05)。在转染miR-124inhibitor的BV-2细胞中，与未经VX702预处理组相比，VX702预处理组TNF-α和IL-1β的分泌量显著减少(P＜0.05)。 4.过表达miR-124能缓解LPS刺激小胶质细胞活化后引起的神经元损伤 构建以条件培养基为基础的共培养体系:将BV-2细胞转染miR-124mimics，LPS(0.1μg/ml)刺激12h后收集上清液。并与新鲜培养基按1∶1的体积比混合后作为条件培养基用于培养神经元细胞SH-SY5Y。24小时后分别用CCK-8法和流式细胞术检测SH-SY5Y细胞的存活率和凋亡率。结果显示:未转染miR-124mimcis组，神经元存活率较低（约40％）而凋亡率较高(16％)。而在过表达miR-124mimics组，神经元存活率明显增高（超过70％），而凋亡率较低(8％)，差异均具有统计学意义(P＜0，05)。 结论：1.在BV-2小胶质细胞中，miR-124抑制LPS诱导的促炎细胞因子分泌。 2.miR-124通过调控p38α抑制小胶质细胞分泌促炎细胞因子。 3.过表达miR-124抑制小胶质细胞活化引起的神经元损伤。