论文部分内容阅读
第一部分:氨甲蝶呤对映体耐药A549细胞株的建立及其生物学特征目的:诱导并建立耐氨甲蝶呤对映体的A549细胞株并观察耐药细胞系（L-（+）-MTX/A549、D-（-）-MTX/A549）的生物学特性。方法:以MTX对映体为诱导剂,采用浓度递增结合低剂量持续诱导方法诱导A549细胞株,建立MTX不同对映体耐药细胞系;倒置相差显微镜观察细胞形态变化;MTT法绘制细胞生长曲线;MTT法检测耐药细胞株的耐药指数;流式细胞仪检测细胞周期和细胞的分裂增殖能力。结果:采用浓度递增结合低剂量持续诱导方法,建立了MTX不同对映体对A549细胞的耐药细胞株,L-（+）-MTX/A549、D-（-）-MTX/A549耐药指数分别为6.0的和20.2。倒置相差显微镜观察细胞形态发生了改变;细胞生长曲线显示D-（-）-MTX/A549的增值略慢于亲本细胞,而L-（+）-MTX/A549的增值最慢;流式细胞仪检测细胞周期结果显示L-（+）-MTX/A549、D-（-）-MTX/A549耐药细胞株S期细胞数量减少（P＜0.05）,G0/G1期细胞增多（P＜0.05）;CFSE检测A549、L-（+）-MTX/A549、D-（-）-MTX/A549的MFI分别为（6.08±0.55）,（7.72±0.30）,（6.90±0.18）。两对映体细胞株间有明显手性差异。结论:本研究建立了MTX两种对映体耐药细胞株并观察了耐药株细胞的生物学特性,为进一步研究氨甲蝶呤两种对映体的耐药机制提供了一种实验模型。第二部分:氨甲喋呤对映体耐药A549细胞株二氢叶酸还原酶提取与纯化目的:建立从A549亲本细胞株和氨甲喋呤对映体耐药A549细胞株中提取纯化二氢叶酸还原酶的方法。方法:A549亲本细胞株和氨甲喋呤对映体耐药A549细胞株中二氢叶酸还原酶的提取流程为:细胞粗提液的制取→PH5.1等电点沉淀→硫酸铵沉淀→sephadex-25凝胶过滤→超速离心→DEAE-sepharose Fast Flow阴离子交换层析→超滤等步骤。所得蛋白用SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,考马斯亮蓝法测定蛋白含量,酶反应测定其活性。结果:成功提取并纯化A549细胞株和氨甲喋呤对映体耐药A549细胞株中的二氢叶酸还原酶,SDS-PAGE电泳显示酶得到了高度纯化,酶反应显示提纯倍数达到48倍,产率为41.4%。结论:使用本流程可纯化得到高纯度的二氢叶酸还原酶,为进一步研究MTX对映体的手性耐药机制奠定基础。