【摘 要】
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唾液蛋白Nlsalivap-7是褐飞虱唾液中一类假定与调控水稻麦黄酮代谢相关的蛋白。本研究旨在阐明唾液蛋白Nlsalivap-7基因在褐飞虱体内的表达模式以及在褐飞虱取食水稻过程中对寄主水稻体内麦黄酮代谢的影响。本研究通过对褐飞虱响应麦黄酮处理的唾液蛋白筛选,利用RT-q PCR分析找到了一条高度响应麦黄酮的唾液蛋白Nlsalivap-7基因。利用RT-PCR结合RACE技术克隆获得了唾液蛋白Nl
【基金项目】
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国家自然科学基金青年项目(31501633); 广东省省级科技计划项目(2016B020202002);
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唾液蛋白Nlsalivap-7是褐飞虱唾液中一类假定与调控水稻麦黄酮代谢相关的蛋白。本研究旨在阐明唾液蛋白Nlsalivap-7基因在褐飞虱体内的表达模式以及在褐飞虱取食水稻过程中对寄主水稻体内麦黄酮代谢的影响。本研究通过对褐飞虱响应麦黄酮处理的唾液蛋白筛选,利用RT-q PCR分析找到了一条高度响应麦黄酮的唾液蛋白Nlsalivap-7基因。利用RT-PCR结合RACE技术克隆获得了唾液蛋白Nlsalivap-7基因的两条可变剪接体12896和19287。利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测褐飞虱唾液蛋白Nlsalivap-7基因的时空表达模式以及取食不同抗性品种水稻TN1、Rathu Heenati、IR36时该基因表达量。研究结果如下:(1)从蛋白质组水平明确了褐飞虱唾液蛋白对麦黄酮胁迫的响应。应用差异蛋白质组学方法分析了褐飞虱唾液腺响应麦黄酮刺激处理的蛋白质组变化,研究结果表明,麦黄酮处理褐飞虱6 h差异蛋白数量90个,其中上调蛋白62个,下调蛋白28个;处理褐飞虱24 h差异蛋白数量27个,其中上调蛋白10个,下调蛋白17个,6 h的差异蛋白数量显著大于24 h。麦黄酮处理可以引起褐飞虱唾液腺丝氨酸蛋白酶及其同系物产生显著变化。通过对差异蛋白进行GO功能分析和KEGG通路分析,发现麦黄酮处理褐飞虱引起褐飞虱唾液腺蛋白变化主要集中在应激蛋白和代谢这两大类上,分别占了所有差异蛋白的50%以上,麦黄酮处理引起褐飞虱唾液响应蛋白主要参与了氨基酸代谢、唾液分泌系统、能量代谢、碳水化合物代谢等通路。通过RT-q PCR对褐飞虱蛋白组分析,发现对于麦黄酮刺激,唾液蛋白基因Nlsalivap-7表达量与空白对照相比上调11.5倍。(2)褐飞虱唾液蛋白Nlsalivap-7可变剪切克隆与表达模式分析。结果通过比对中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室的褐飞虱基因组数据库(未公开),显示唾液蛋白Nlsalivap-7基因有两条相似序列,利用RACE技术扩增唾液蛋白Nlsalivap-7基因全长,测序结果得到唾液蛋白Nlsalivap-7基因两个转录本(19287和12896)。19287剪接体在1-5龄若虫几乎不表达,成虫期都有不同程度的表达,成虫在9、11、13、15 d时表达量略高于其他成虫临期,19287剪接体在Rathu Heenati水稻品种饲养的褐飞虱体内表达量低于TN1水稻品种上饲养的褐飞虱83.09%,差异显著,TN1种群与IR36种群差异不显著,19287剪接体在褐飞虱唾液腺中表达量最高,其次为中肠,头部,而在脂肪体、足、卵巢中几乎不表达。12896剪接体在2-4龄若虫时期几乎不表达,在1龄若虫和成虫9、13、15有少量表达,在成虫11 d表达较高于其他成虫龄期,12896剪接体在三种不同抗虫性水稻品种饲养的褐飞虱种群体内表达量没有显著差异,12896剪接体在中肠和唾液腺中表达量较高,且足中也有表达,在脂肪体、头部、卵巢中表达量较低。(3)褐飞虱唾液蛋白Nlsalivap-7基因功能研究。RNA干扰褐飞虱刚羽化1 d雌成虫12896和19287剪接体后,可显著降低上述两个可变剪接体的表达水平,19287剪接体表达量在48 h与对照组对比降低了81.36%,72 h后达到显著水平,仅为对照组的1.13%,而12896在48 h降低了91.27%,在72 h表达量仅为1.58%,几乎不表达。沉默19287褐飞虱所产生的蜜露量比对照组减少了7.8%,而沉默12896剪接体后褐飞虱所产生的蜜露量减少了52.5%;沉默19287、12896剪接体的褐飞虱均可刺激褐飞虱在寄主植物上的取食频率,具体表现为RNA干扰褐飞虱后在水稻茎秆口针造成的取食痕显著高于对照,沉默19287剪接体的褐飞虱在水稻茎秆上留下的取食痕增加了1倍,沉默12896剪接体后褐飞虱在水稻茎秆上留下的取食痕增加了1倍;沉默19287剪接体的褐飞虱体重减少了31.79%,沉默12896剪接体的褐飞虱体重减少了24.16%,均显著低于对照。明确了唾液蛋白Nlsalivap-7基因参与调控寄主植物水稻体内麦黄酮代谢。不同的可变剪接体在调控TN1水稻麦黄酮代谢和褐飞虱代谢上作用存在差异。TN1水稻受RNA干扰19287剪接体褐飞虱为害后,麦黄酮含量升高了2.3倍,高于对照组褐飞虱为害后的TN1水稻,受RNA干扰12896剪接体的褐飞虱为害后与对照组差异不显著。可见,褐飞虱唾液蛋白Nlsalivap-7基因19287和12896剪接体均有抑制水稻麦黄酮代谢功能,而12896剪接体可能在调控褐飞虱感应麦黄酮和代谢过程中也发挥了重要作用。
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