黄疸是一种常见临床病症,始于《内经》记载,历代发展已从传统的围绕脾胃为中心的治黄原则,发展到强调以肝胆为中心的治黄新理论。黄疸主要表现为肝细胞性、肝功能损伤,使肝细胞摄取和排除胆红素功能减弱,最终导致血液中胆红素水平升高,表现为巩膜、黏膜以及皮肤黄染等现象。梗阻性黄疸是由于胆汁排泄发生梗阻,可因肝内或肝外病变所致。肝内常见原因是病毒性肝炎,较少见原因包括原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC),肝外原因常见于胆总管结石或胰腺癌,不常见原因有原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis,PSC)等。由于胆汁流动障碍易形成胆汁淤积,导致胞内蓄积胆酸盐和胆红素等有毒胆汁成分,对肝脏等器官造成继发性损伤。如果不予处置,胆汁淤积逐渐发展为肝纤维化和肝硬化,最终导致肝功衰竭,进而需要肝脏移植治疗。目前,对于病因明确的胆汁淤积,如有可能均应力争根治或控制基础疾病。对于胆小管的免疫性损伤,免疫抑制剂效果并不明显,最满意的治疗在于成功的改善症状,延迟或阻止疾病的恶化。熊去氧胆酸(UDCA)有利胆的作用,能增加胆汁的分泌,对I期和II期的PBC有效,也是PSC患者内科治疗的较好药物,但并不能改善生存率。因此,开发新的药物治疗胆汁淤积是临床面临的迫切任务。绿原酸(Chlorogenic acid),亦称咖啡鞣酸,是咖啡酸和奎宁酸形成的酯,提取自忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或待初开的花,作为药品、保健品、化妆品的原料,半水合物为针状结晶。流行病学研究提示,经常摄入咖啡、茶、红酒、植物药以及某些果汁可以有效的减少多种慢性疾病的发生和进展,这些食物通常富含绿原酸。绿原酸产生有益身体健康的机制主要涉及缓解氧化压力,减少胞内氧化应激产生的不良反应。绿原酸调节一系列重要的代谢途径,发挥抗炎活性。此外,绿原酸还具有抗菌、抗癌和降血糖、降血压、利胆作用,能增进大鼠的胆汁分泌。由于抗氧化和抗炎活性显著,绿原酸对药物/毒物诱导的肝损伤具有保护作用。中药茵陈中也含有丰富的绿原酸,在我国用于治疗肝胆疾病,已经具有上千年的历史,研究表明绿原酸是其肝保护作用的活性成分之一,然而其肝保护作用机制尚不明确。肝脏转运体表达在肝细胞的基底侧(血管侧)膜和顶侧膜(胆管侧)上,是胆汁摄取和分泌的决定性因素。胆汁原料进入肝脏后,CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1合成胆汁酸,UGT1A1等II相结合酶催化胆汁成分由游离型向结合型转变。核受体是调控胆汁相关转运体和代谢酶的重要转录因子,成为治疗胆汁淤积性肝疾病的新靶点。药代动力学描述药物的体内过程,包括吸收、分布、代谢和排泄。药代动力学反应药物的血药浓度随时间变化的趋势,是制订给药方案的重要参考。深入理解药物的药动学属性,才能安全有效的在临床应用药物。药动学是人体对药物的处置过程,因而存在较大的个体差异。年龄、性别、疾病等因素都能改变药动学,继而改变药物的效应。在疾病条件下,机体对药物吸收、代谢、排泄能力受到病理环境的干扰,因此需要根据个体情况,综合考虑药动学的变化,制定个体化的给药方案。绿原酸在正常条件下的药动学已经研究充分,然而疾病条件下,绿原酸药动学的变化尚未深入研究。本研究拟利用大鼠胆管结扎模型,考察梗阻性黄疸后肝胆转运系统的表达变化,阐明绿原酸肝保护作用的肝胆转运系统机制。同时,考察胆管结扎大鼠绿原酸的药代动学变化,为绿原酸在临床患者中的安全合理有效应用提供参考。第一部分绿原酸对胆管结扎诱导的大鼠梗阻性黄疸的作用目的:建立大鼠胆管结扎模型,初步评价绿原酸对胆管结扎诱导的大鼠梗阻性黄疸的保护作用。方法:大鼠随机分为假手术组,假手术给药组,模型组,低剂量治疗组,中剂量治疗组,高剂量治疗组,分别行假手术或胆管结扎术。术后3天和7天,分别检测ALT、AST、胆红素、胆汁酸等肝功能指标,并利用病理切片从形态学上观察胆管结扎对大鼠肝功能的影响,以及绿原酸对肝功和肝组织形态学的影响。结果:1.胆管结扎后,血清ALT、AST、胆红素、胆汁酸水平显著升高,造模3天后,肝组织HE切片显示肝细胞和胆管上皮细胞肿胀,肝血窦扩张,炎性细胞浸润增生。造模7天后,肝小叶结构破坏,肝细胞肿胀坏死,坏死灶中出现胆汁淤积,肝血窦扩张、细胞肿胀及炎性细胞浸润更加明显。2.绿原酸治疗组血清ALT、AST、胆红素、胆汁酸水平较模型组显著下调,肝HE切片显示肝血窦扩张,胆管细胞增生伴炎性细胞浸润,肝细胞浊肿,但程度较模型组较轻。结论:绿原酸对胆管结扎诱导的肝损伤具有保护作用,并有效的降低胆红素和胆汁酸水平。第二部分绿原酸对胆管结扎诱导的大鼠梗阻性黄疸的作用机制研究目的:揭示绿原酸对肝胆转运系统的表达影响,阐明绿原酸调控肝胆转运系统的分子机制。方法:利用real time PCR和western blot实验考察肝脏摄取转运体Ntcp,Oatp1a1,Oatp 1a4,和Oatp 1b2,肝脏外排转运体Bsep和Mrp 2/3/4,胆汁酸合成酶Cyp 7a1,Cyp 8b1,和Cyp 27a1,以及胆红素代谢酶Ugt 1a1的表达变化。并考察肝胆转运代谢系统的上游调控核受体FXR、CAR以及SIRT1的表达变化。结果:1.胆管结扎后,肝脏摄取转运体Ntcp,Oatp 1a4,和Oatp 1b2的表达下调,肝脏外排转运体Bsep和Mrp 2/3/4表达上调,胆汁酸合成酶Cyp 7a1,Cyp 8b1,和Cyp 27a1被抑制,胆红素代谢酶Ugt 1a1的表达上调。绿原酸治疗后,肝脏胆汁酸及胆红素的相关转运体及代谢酶的表达变化程度加大。2.胆管结扎后,FXR和CAR被激活,m RNA水平上调,而绿原酸处理不改变FXR和CAR的表达水平。绿原酸处理后,去乙酰化的FXR和PGC-1α水平上调,SIRT1表达水平上调。结论:绿原酸下调肝脏摄取型转运体,上调外排型转运体,抑制胆汁酸合成酶,上调胆红素代谢酶,促进胆汁酸和胆红素从肝细胞中排出,减少胆汁酸和胆红素对肝细胞的毒性。第三部分正常大鼠及胆管结扎大鼠口服绿原酸后的药动学比较目的:拟建立灵敏、快速、高效、专属的LC-MS/MS方法用于大鼠血浆中绿原酸的测定,考察胆管结扎大鼠口服绿原酸后的药代动力学变化。方法:采用甲醇沉淀蛋白法处理大鼠血浆,色谱分离应用Hypersil ODS-C18色谱柱,电喷雾电离源(ESI)负离子检测,多反应监测(MRM)模式测定大鼠血浆中绿原酸的浓度。其中,m/z 353?m/z 191,m/z 179?m/z 135分别作为绿原酸、咖啡酸(内标)定量分析时监测的离子对,色谱分离的流动相为甲醇-水-甲酸(20:80:0.097,v/v/v)。应用建立的分析方法,考察正常和胆管结扎大鼠口服绿原酸100mg/kg后血药浓度的变化。结果:通过优化质谱、色谱和样品预处理等条件成功建立了灵敏、快速的LC-MS/MS法测定大鼠血浆中的绿原酸的分析方法。绿原酸的线性范围均为1.00~1000 ng/m L。分析时间为3min。分析方法的日内和日间精密度、准确度、回收率、基质效应、稳定性等考察指标均达到相关规定要求。正常大鼠和胆管结扎大鼠口服绿原酸后Cmax和AUC显著增大,半衰期延长结论:建立的LC-MS/MS分析方法成功应用于绿原酸的大鼠药动学实验中。