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颅脑损伤是一种严重而复杂的创伤,它不仅包括由外力直接所致的中枢神经系统的原发性损伤,更有一系列继发性损伤接踵而至,这些继发性损伤也是导致颅脑损伤病人死亡或残废的重要原因。能够诱发机体产生脑的继发性损伤的生化物质被称为内源性脑损伤因子,目前比较公认的内源性脑损伤因子主要包括:乙酰胆碱、Ca2+、儿茶酚胺、兴奋性氨基酸、内源性阿片肽、氧自由基、缓激肽、5-羟色胺、组织胺等。而Ca2+又是其中最受重视的一个因子。 钙离子作为神经元胞内的重要信使,参与神经递质的合成与释放,神经兴奋性的维持,突触的可塑性及多种酶的活动。钙离子的信使作用主要是通过胞浆内外浓度差的改变来实现的。正常静息状态下,细胞内外Ca2+存在着10,000倍左右的浓度差,当细胞受到刺激时,细胞外Ca2+主要经电压依赖性通道(VDCC)和受体操纵性通道(ROCC)进入胞质,使胞浆中的钙离子浓度急速上升,这种胞内钙离子浓度的急剧增高现象,尤其在各种类型的脑损伤时更为明显,甚至形成细胞内钙超载。目前认为细胞内钙超载对继发性脑损伤的发生和发展起决定性的作用,也是多种情况下细胞死亡的最后共同通路。脑外伤后引起神经元细胞浆内钙超载的具体原因目前仍不十分清楚,但普遍认为脑外伤后细胞外钙离子通过钙通道大量流入神经元内,是造成神经细胞钙超载的主要原因。神经细胞的钙超载将触发细胞内一系列反应,其中主要有:(1)激活磷脂酶A2,促使氧自由基形成,启动膜脂质过氧化;(2)结合到作为效应物的专一性蛋白质钙调蛋白(CaM)上,然后CaM能与专门的酶结合,从而激活蛋白酶、核酸内切酶,导致神经丝降解,微管解聚,神经元骨架破坏;3)钙与线粒体膜结合后,能阻断线粒体电子转递,从而阻断ATP能量产生。这些反应都将直接或间接造成神经元的损伤。 亚低温治疗的脑保护作用,已为人们所公认。1991年江基尧在国际上首先证实 3D刁3 oC低温对实验性颅脑损伤动物有显著的保护作用。它能显著降低脑外伤动物死亡率,促进脑外伤后运动神经功能恢复,防止继发性颅内高压形成,减轻颅脑伤后脑组织病理形态损害等。但亚低温脑保护的确切机理仍不十分清楚。 本课题通过激光扫描共聚焦显微镜技术,测定颅脑损伤后脑细胞内钙离子浓度变化,除了进一步证实颅脑损伤后存在脑细胞钙离子超常增加现象以外,着重于探讨颅脑损伤后亚低温状态下钙离子代谢变化规律,揭示亚低温脑保护机制与钙离子代谢之间的关系。 材料和方法 本实验通过Wstar大鼠硬膜外自由落体打击法来制备颅脑损伤动物模型。将54只大鼠随机分成H组: 门)假手术组(正常对照组,6只人麻醉后在位于大鼠冠状缝。人字缝之间,矢状缝右侧作直径约srnm的颅骨骨窗,注意保持硬脑膜完整,不打击。 *)常温组(颅脑损伤组,24只):麻醉后依上述方法开骨窗暴露硬脑膜,20克硅码从 3 0 cm高处自由坠落,撞击于硬膜外的圆锥体上(直径4mm人 造成对应部位脑组织的机械性损伤。 3)亚低温治疗组(颅脑损伤十亚低温处理组,24只人 麻醉后依上述方法打击,并马上给予腹部冰袋降温,使肛温保持在 32刀℃左右,维持约3小时,然后让其自然复温。 常温组和亚低温组伤后ZV。时、6小时、24小时、船小时时相各有6只大鼠进行检测。 本实验用肛温测定代替脑温,因为对小动物两者在一定程度上可 一2-以相互替代。 假手术组动物于术后2小时断头处死,并切取脑标本进行检测;而第2、3组动物分别于伤后2小时、6小时、24小时、48小时将大鼠处死后,取右顶叶挫伤缘大脑皮层组织检测。各组标本剪碎并放入胰蛋白酶溶液中消化,然后经过分离、贴壁、荧光染色、孵育等步骤,在激光共聚焦显微镜下检测。选择结构完好的脑细胞进行扫描,分析时选荧光最强的层面作为计算标准,每个样本取10个细胞计算其平均值作为它的钙离子荧光像素值,并计算出同一时相不同大鼠的脑细胞内钙离于荧光像素平均值。 统计学分析:荧光像素值以平均值士标准差(了土S)来表示。分别比较假手术组和常温组、亚低温治疗组伤后不同时相脑细胞内钙离子荧光像素值之间的差异k检验人 结果 1.对照组大鼠脑细胞内钙离子荧光强度维持在较低的水平。 2.常温组大鼠各时相脑细胞内钙离子荧光强度与对照组相比,均有非常显著性差异p动刀1人在伤后2小时即有明显升高,约在24小时左右达到高峰。 3.亚低温组大鼠伤后6小时、24小时、48小时脑细胞内钙离子荧光强度明显低于同时相常温组且具有非常显著性差异0<0刀1人 结论 1.颅脑外伤后存在胞内钙大量增加的现象,构成了胞内钙超载的基础。 L 亚低温能够减轻颅脑外伤后大量胞外钙移入胞内,减少脑细胞