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实验目的: 本课题研究京尼平苷的抗衰老作用及其机制,为延缓衰老,提高生命质量提供实验依据和理论参考。 实验方法: 在细胞水平上,采用D-gal诱导PC12细胞衰老模型,使用β-半乳糖苷酶试剂盒检测细胞衰老模型是否建立成功,采用MTT法检测京尼平苷对衰老PC12细胞活性的影响;DCFH-DA染色实验检测衰老PC12细胞中活性氧(ROS)水平;化学试剂法检测PC12细胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活性、丙二醛(MDA)以及谷胱甘肽(GSH)的含量变化;Western blot实验检测衰老PC12细胞中凋亡蛋白Bcl-2和记忆相关蛋白CREB的表达。Real timePCR实验检测京尼平苷对衰老PC12细胞中CREB基因mRNA表达的影响;动物实验中,采用D-gal建立小鼠衰老模型,化学试剂法检测模型小鼠血清和脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性以及谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量变化;水迷宫(Morriswater maze)实验检测京尼平苷对模型小鼠学习和记忆能力的影响;Western blot实验检测模型小鼠海马体中记忆相关蛋白CREB和凋亡蛋白Bcl-2的表达。 实验结果: 在细胞实验中,β-半乳糖苷酶染色实验显示25 mg/mLD-gal孵育PC12细胞24 h,β-半乳糖苷酶阳性细胞蓝染率明显增加;MTT实验中,给予100μM京尼平苷干预后,结果显示京尼平苷能够增加衰老PC12细胞的活性以及降低衰老PC12细胞的β-半乳糖苷酶阳性细胞蓝染率;DCFH-DA染色实验显示,京尼平苷可以降低衰老PC12细胞中活性氧的水平;化学试剂法实验结果显示京尼平苷可以提高衰老PC12细胞内超氧化物歧化酶(SOD)的活性和谷胱甘肽(GSH)的含量以及降低丙二醛(MDA)的含量;Western blot实验结果显示,京尼平苷上调了衰老PC12细胞中记忆相关蛋白CREB和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。Real time PCR实验结果表明京尼平苷增加了衰老PC12细胞中CREB mRNA的表达。 在动物模型实验中,160 mg/kgD-gal溶液体内诱导7周龄KM小鼠亚急性衰老,用京尼平苷干预后,实验结果表明京尼平苷对衰老小鼠有神经保护作用。京尼平苷可以提高衰老小鼠血清及脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性,增加了谷胱甘肽(GSH)的含量,并且降低丙二醛(MDA)的含量;水迷宫实验结果显示,京尼平苷能够增加衰老小鼠的平台穿越次数并且缩短衰老小鼠的逃避潜伏期,说明京尼平苷能够改善衰老小鼠的学习和记忆能力;通过Western blot实验发现京尼平苷上调了衰老小鼠海马体中记忆相关蛋白CREB的表达,同时也上调了Bcl-2蛋白的表达,从而减少神经元的凋亡。 实验结论: 京尼平苷通过降低细胞活性氧的水平,减少衰老细胞氧化损伤,减少细胞凋亡、提高学习和记忆能力,从而发挥体内外的抗衰老作用。