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研究背景和目的我国最新的癌症统计数据(2015)显示,食管癌(esophageal cancer,EC)在男性中发病率位列第三,仅仅次于肺癌和胃癌,在女性中位列第五,死亡率均列第四。多学科综合治疗的治疗模式问世以来,大大提高了食管癌患者的治疗效果,但总体来说,食管癌患者5年生存率仍然不超过20%。食管癌预后差的原因之一在于很多患者一经诊断即为晚期,往往已经出现局部浸润以及广泛的淋巴结转移。向邻近正常组织的浸润以及淋巴结转移,这是EC最主要的生物学特性,成为临床提高患者预后的最主要障碍。肿瘤逃避免疫系统攻击的途径之一是通过形成抑制性肿瘤微环境(TME,tumor microenvionment)来对抗抗肿瘤免疫反应。TME是由肿瘤细胞、淋巴细胞、淋巴样内皮细胞以及它们分泌的因子等组成的复杂系统,TME的改变与肿瘤进展密切相关。因此本研究中我们将主要探讨食管癌TME中肿瘤细胞与免疫细胞之间的关系以及相关分子机制,为开发食管癌新的免疫疗法提供新的思路。吲哚加双氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)属于含血红素的单体氧化还原酶类,是介导色氨酸(tryptophan,TRP)向犬尿酸(kynurenine,KYN)代谢的限速酶。IDO1在多种肿瘤类型中高表达,它通过介导色氨酸代谢为犬尿酸进而诱导Treg的产生,同时影响T细胞的增殖和杀伤功能,从而使肿瘤细胞逃避免疫系统监视发生免疫逃逸。越来越多的研究发现IDO的高表达与肿瘤进展密切相关,在肝细胞癌、非小细胞肺癌、结肠癌、侵袭性宫颈癌中都有相关报道发现IDO高表达,并导致患者的不良预后。因此研究人员开发出多种IDO1小分子抑制剂,在一系列临床前实验和临床试验中发现IDOl抑制剂单药或者联合其它免疫疗法可以恢复T细胞的抗肿瘤免疫反应,从而达到不同程度的抑制肿瘤发生发展的效应。但是,IDO1在食管癌中是否表达,它在食管癌微环境中发挥了怎样的作用,IDO1抑制剂是否可以应用于食管癌却没有相关研究报道。我们首先在第一部分检测食管癌患者肿瘤组织及远端正常组织中IDO1的表达,收集患者的临床病理信息,回顾性分析了IDO1的表达与食管癌患者临床病理参数之间的关系,发现IDO1的高表达与食管癌患者的不良预后有明显相关性。然后进入第二部分筛选了常用食管癌细胞系中IDO1的表达,选取组成性表达最高的EC1进行后续实验。通过在食管癌细胞EC1中稳定敲低IDO1,用多因子检测的方法发现IDO1影响了EC1中CXCL8的分泌,进一步检测KYN的产生我们发现,IDO1通过激活KYN/CXCL8/CXCR1通路增加了中性粒细胞的趋化。为了探讨KYN影响食管癌细胞CXCL8表达的机制我们在第三部分利用转录因子PCR array的方法筛选出影响CXCL8的转录因子NFATC2,然后通过一系列体外实验证实,IDO1通过KYN激活NFATC2进而促进CXCL8的转录和分泌。最后在第四部分我们利用动物模型以及食管癌患者肿瘤组织样本证明食管癌中IDO1在体内同样可以通过激活NFATC2/CXCL8通路增加中性粒细胞的招募。综上所述,本文主要研究了IDO1在食管癌中的表达和意义,并探讨IDO1在食管癌微环境中发挥的作用及机制,为靶向IDO1的治疗策略应用于食管癌提供必要的理论依据。第一部分IDO1在食管癌患者中的表达和意义研究方法1)荧光定量PCR(quantitative-PCR,Q-PCR)方法检测食管癌患者肿瘤组织和配对远端正常组织中IDO1的表达。2)免疫组化方法检测食管癌肿瘤组织中IDO1蛋白水平的表达。研究结果1)IDO1在食管癌组织中表达显著高于远端癌旁正常组织。2)IDO1的表达程度与食管癌患者TNM分期和肿瘤分级明显相关。3)ID01高表达的食管癌患者与低表患者相比较,生存明显较差。第二部分食管癌细胞中IDO1通过上调CXCL8增加了中性粒细胞的招募研究方法1)多因子筛选方法筛选与IDO1功能相关的细胞因子和趋化因子。2)液相色谱/质谱联用了解IDO1稳定敲低后食管癌细胞EC1中色氨酸和犬尿酸含量的变化。3)磁分选方法从外周血中分离纯化的中性粒细胞。4)Transwell方法检测敲低IDO1前后及KYN作用前后的食管癌细胞上清招募中性粒细胞的能力。5)Elisa方法检测不同处理手段作用前后食管癌上清中CXCL8的分泌量。6)流式细胞仪检测和分析中性粒细胞磁分选的纯度和表面受体CXCR1和CXCR2的表达。研究结果1)IDO1对食管癌细胞的增殖和凋亡没有影响。2)IDO1可以促进食管癌细胞CXCL8的分泌。3)食管癌细胞中IDO1通过介导KYN的产生来促进CXCL8的分泌。4)食管癌细胞中IDO1通过KYN/CXCL8/CXCR1来招募中性粒细胞。第三部分IDO1通过活化KYN/NFATC2通路调节CXCL8的表达研究方法1)转录因子PCR array方法筛选与IDO1和KYN功能密切相关的转录因子。2)免疫荧光方法观察KYN诱导活化T细胞核转录因子(Nuclear factor of activated T cell,NFAT)激活发生核转位的现象。3)Western Blot方法证明KYN可以介导NFATC2从胞浆中转移至细胞核中。4)双荧光报告系统实验观察CXCL8启动子区的转录激活。5)CHIP方法验证转录因子NFATC2与CXCL8启动子区的直接结合。研究结果1)IDO1通过NFATC2来促进CXCL8的产生。2)KYN可以促进NFATC2活化。3)NFATC2通过直接与CXCL8的启动子区域结合促进了 CXCL8的转录。第四部分食管癌组织中IDO1通过激活KYN/NFATC2/CXCL8通路增加中性粒细胞的浸润研究方法1)动物实验证明在体内食管癌IDO1可以诱导NFATC2/CXCL8通路的激活进而增加中性粒细胞向肿瘤部位的趋化。2)免疫组化方法检测食管癌肿瘤组织中CXCL8和中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)蛋白水平的表达。研究结果1)动物模型中IDO1可以通过激活NFATC2/CXCL8通路增加中性粒细胞的招募。2)食管癌患者肿瘤组织中CXCL8高表达且提示患者的不良预后。3)IDO1高表达CXCL8高表达的食管癌肿瘤组织中性粒细胞浸润明显较多。结论1)IDO1在食管癌组织中高表达而且提示食管癌患者的不良预后。2)食管癌细胞中IDO1通过上调CXCL8增加了中性粒细胞的招募。3)IDO1通过活化KYN/NFATC2通路调节CXCL8的表达。4)食管癌组织中IDO1通过激活KYN/NFATC2/CXCL8通路增加中性粒细胞的浸润。