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背景与目的:足细胞损伤与丢失是肾小球疾病进展的重要原因,作为有丝分裂后细胞重要保护机制的自噬反应对足细胞至关重要。在正常肾脏中足细胞的自噬水平明显高于其他细胞,提示自噬可能在维持足细胞稳态过程中发挥重要作用。有研究指出正常情况下足细胞内存在低mTOR高自噬的mTOR-autophagy平衡,故而mTOR-autophagy平衡改变对足细胞内环境稳态存在影响,其具体机制还不明确。本文旨在通过被动型海曼肾炎大鼠模型以及嘌呤霉素氨基核昔酸培养的足细胞探求mTOR-自噬活性改变与足细胞损伤的具体机制。
方法:采用3月龄SD雄性大鼠建立足细胞损伤的被动型海曼肾炎模型,在模型建立的1d、7d、14d、21d及28d处死大鼠,留取肾皮质,处死前留取24h尿样。体外用嘌呤霉素氨基核苷酸(puromycin aminonucleoside,PAN)处理小鼠足细胞条件永生系(Mouse Podocyte cell5,MPC5),模拟体内足细胞损伤建立体外足细胞损伤模型,模型建立成功后用雷帕霉素(rapamycin)处理细胞或转染siRNA。利用western blot及免疫荧光染色技术对模型大鼠肾皮质及处理过的足细胞进行分析。
结果:与对照组大鼠相比,模型大鼠在7d时出现明显蛋白尿,足细胞骨架相关蛋白synaptopodin表达下调,自噬水平较低,此时mTOR信号通路激活,其相关蛋白p-mTOR、p-p70S6K及p-4EBP1表达水平明显上调,提示mTOR信号通路的激活与足细胞损伤有关。14d时mTOR信号通路依然处于活化状态,足细胞损伤至最重,此时自噬水平明显上调。21d时mTOR信号通路明显弱化,而自噬水平依然较高,足细胞损伤减轻,可见自噬反应的上调可以保护受损的足细胞,减轻足细胞损伤。体外实验中,足细胞损伤时mTOR信号通路活化,自噬起始关键蛋白ULK1磷酸化水平上调,自噬受抑制。用rapamycin处理细胞后,发现自噬水平上调,p-ULK1水平下调,足细胞损伤明显好转,rapamycin能够通过抑制mTOR-ULK1通路减轻足细胞损伤。利用siRNA干扰自噬反应后,即使采用rapamycin处理足细胞损伤并没有减轻,表明白噬对足细胞有保护作用,它能够帮助足细胞从损伤中恢复。
结论:在体内与体外实验中我们均发现了足细胞损伤与自噬水平的改变有关,损伤发生时mTOR通路的活化可能是自噬水平下调及足细胞损伤的重要原因。Rapamycin能够通过抑制mTOR上调自噬水平减轻足细胞损伤,上调的自噬水平能够保护受损的足细胞,帮助其从损伤中恢复。这一发现为曰后涉及足细胞损伤的肾脏疾病的治疗提供了重要的理论依据。