论文部分内容阅读
克里米亚-刚果出血热(Crimean-Congo hemorrhagic fever, CCHF)是一种由虫媒病毒克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV)引起的蜱传疾病，致死率高达30％，对于CCHF目前没有特异性的疫苗和治疗药物。CCHF在全球分布广泛，在非洲，亚洲和欧洲的30多个国家都有发现。在中国有关CCHF的最早报道是1965年新疆巴楚地区的CCHF爆发，其后该疾病一直在新疆地区流行，随后在云南、四川和青海省的人或动物血清中检测到了CCHFV-IgG阳性抗体。为给进一步研究CCHFV生物学特征和疫苗药物的开发奠定分子生物学基础，本论文进行了CCHFV基因组全长cDNA克隆和小基因组系统的构建。为研究CCHFV流行病学特征，对中国云南省西南部人群CCHFV感染危险因素进行了分析，并对该地区蜱样本进行了检测。
本研究以中国新疆分离株YL04057为研究对象，通过提取病毒RNA，反转录为cDNA模板，用保真Taq酶扩增S片段全长，M片段部分片段M1和M2，L片段部分片段L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8。S片段直接连接到pGEM-T载体，M和L的部分片段先连接到pGEM-T载体，再通过OverlapPCR和酶切连接的方法融合，获得了M和L片段全长。最终获得含有S、M和L片段全序列的cDNA克隆：pGEM-T/CCHFVS、pGEM-T/CCHFVM和pGEM-T/CCHFVL。以pGEM-T/CCHFVS为模板扩增S片段的非翻译区(UTR)，以pEGFP-N1为模板扩增绿色荧光蛋白(EGFP)的基因编码区(ORF)区，连接到pRF42载体，构建小基因组pRF/S-GFP;以pGEM-T/CCHFV S和pGEM-T/CCHFV L分别为模板，扩增S片段和L片段的ORF区，并分别连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建表达病毒核衣壳蛋白(NP)和RNA聚合酶(L蛋白)的质粒pcDNA/S和pcDNA/L。将这3个质粒共转染BHK-21细胞后，可观察到绿色荧光细胞，表明初步成功构建了YL04057株小基因组系统。对CCHF流行病学调查研究，采用简单随机抽样方法在中国云南省西南部(孟连，勐海，勐腊，澜沧和西盟地区)抽取1657人为研究对象，收集相关资料并采集血液样本检测CCHFV-IgG抗体。使用SPSS软件对相关资料进行单因素以及多因素Logistic回归统计学分析，评估CCHFV感染的危险因素。此外，还采集了1280只蜱，对蜱样本进行了荧光PCR分析，检测CCHFV核酸。人群中CCHFV-IgG的阳性率为3.4%(57/1657)，蜱样本的阳性率为14.3%(6/42)，表明蜱样本中的抗原与血清样本中的抗体有一定相关性。多因素分析显示可能增加CCHFV感染的危险因素为有蜱叮咬或接触史(OR16.6，CI7.5-37.0)和年龄大于30岁(OR6.8，95%CI1.6-28.2)。这一地区的人群需要注意采取自我防护措施，防止被蜱叮咬，并且要加强有关的公共卫生教育。