研究背景载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3G(APOBEC3G)是最近发现的胞嘧啶脱氨酶家族成员,由384个氨基酸组成,分子量为46kD,共含有两个胞嘧啶脱氨酶结构域,可以催化单链DNA胞嘧啶脱氨基生成尿嘧啶。APOBEC3G是重要的天然免疫因子,参与机体的抗病毒防御,APOBEC3G在病毒包装过程中以出芽的方式包装入病毒颗粒,随感染病毒颗粒进入新感染细胞发挥作用。APOBEC3G通过催化HIV和HBV等逆转录病毒基因组发生dC脱氨基生成dU或直接抑制病毒逆转录酶活性而发挥抗病毒作用。APOBEC3G可以在肺脏、肝脏、脾脏、睾丸、卵巢等组织以及外周血粒细胞和淋巴细胞中广泛表达,但是对于A3G转录水平调节的研究甚少,目前的研究主要集中在肝细胞和淋巴细胞中的表达调控。研究表明佛波酯可以通过PKCα/βⅠ/MEK/ER途径诱导AOPBEC3G的表达;IFNα则可以通过不依赖STAT1途径诱导AOPBEC3G的表达;IFNγ、IL2、IL15和IL7等多种细胞因子亦可诱导A3G转录。HCV病毒也可以影响APOBEC3G的表达,其NS5A蛋白可以激活APOBEC3G的转录从而上调APOBEC3G蛋白表达。核转录因子Sp1和Sp3可以与APOBEC3G启动子区域的GC-box结合,参与APOBEC3G基本转录的调控。但是对于其他核转录因子对APOBEC3G转录的调控以及HBV能否影响AOPBEC3G的转录则未见报道。研究目的:1、研究上游激活转录因子1(upstream stimulatory transcription factor1,USF1)基因对APOBEC3G的转录调控作用。2、研究HBV对APOBEC3G转录调控的影响。研究方法:1、通过在线软件对AOPBEC3G启动子全长分析,寻找潜在的转录因子结合位点。2、pcDNA3.1(+)-USF1载体构建:抽提HepG2细胞总RNA,逆转录成cDNA,PCR扩增USF1基因后连接到pMD18-T载体,以M13F和M13R为引物PCR鉴定有目的片段插入证明pMD-USF1载体构建成功,测序并与UCSC数据库序列比对正确无误后抽提质粒,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上构建pcDNA3.1(+)-USF1重组体,大量抽提质粒,转染Huh7细胞48小时后提取细胞总蛋白通过western blot鉴定其表达情况。3、过表达USF1基因对A3G的影响:分别以pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-UF1质粒瞬时转染Huh7细胞,转染后48小时抽提细胞总RNA,用Real-time RT-PCR检测APOBEC3G mRNA的变化;分别以pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-SUF1质粒转染Huh7细胞,加入G418筛选稳定转染细胞系,抽提细胞总RNA,用Real-time RT-PCR检测APOBEC3G mRNA的变化。4、降低USF1基因表达对APOBEC3G的影响:合成USF1小干扰RNA片段瞬时转染Huh7细胞,转染后48小时提取细胞总蛋白通过western blot检测对USF1基因的干扰效果。提取细胞总RNA,用Real-time RT-PCR检测APOBEC3G mRNA的变化。5、利用双报告基因系统检测USF1基因对APOBEC3G启动子的影响:pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-UF1质粒分别与pGL3-A3G载体共转染Huh7细胞和HepG2细胞,在转染过程中为平衡转染效率,加入phRL-SV40质粒作为内参同时为了保证转染的DNA分子数和质量数一致,加用鱼精DNA补足质量。转染后48小时裂解细胞检测双萤光素酶的活性,观察在不同细胞中USF1基因对APOBEC3G启动子的影响,保持转染DNA总量以及pGL-A3G的量不变的情况下,采用不同剂量的pcDNA3.1(+)-USF1质粒与pGL-A3G质粒共转染Huh7细胞,观察USF1基因对APOBEC3G启动子影响的剂量效应。6、确定USF1基因在APOBEC3G启动子上的作用位点:对APOBEC3G启动子全长进行分析,根据APOBEC3G启动子上E-box序列所在位置,设计引物PCR扩增一系列5’截短的APOBEC3G启动子序列扩增位点分别位于转录起始位点上游-1130、-795、-232、-159、-84和-54处,酶切后连接到pGL3载体上,测序确认与与GenBank登录序列一致然后抽提质粒分别与pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-SUF1质粒共转染Huh7细胞,检测双萤光素酶的活性,确定在APOBEC3G启动子上可能与USF1蛋白结合的E-box位点。7、观察USF1对定点突变E-box后的APOBEC3G启动子影响:采用QuickChange定点突变试剂盒对APOBEC3G启动子上-91/-86处的E-box进行定点突变,使其由CAGCTG序列变为CAATTG,测序确认突变成功后抽提质粒酶切后重新与pG13载体连接,构建成pGL3-A3Gmut重组载体,然后分别与pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-SUF1质粒分别共转染,同时将未突变的pGL3-A3G质粒分别与pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-SUF1质粒共转染作为阳性对照。检测双萤光素酶活性,观察USF1基因是否能激活突变后的pGL-A3G载体萤光素酶表达。8、研究HBV对APOBEC3G启动子影响:将pUC19-1.24HBV载体与pGL3-A3G共转染Huh7细胞,48小时后裂解细胞检测双萤光素酶的活性,观察HBV是否影响APOBEC3G启动子活性。9、HBV病毒蛋白对AOPBEC3G启动子的影响:将编码HBV病毒大S抗原、核心抗原、e抗原的真核表达载体与pGL3-A3G载体共转染Huh7细胞,检测双萤光素酶活性,观察上述三种蛋白是否影响APOBEC3G启动子活性。10、HBV P基因RT区段重组腺病毒表达研究:采用PCR方法从pUC19-1.24HBV质粒中扩增RT/RNaseH区段,将该片段与pCMV-Tag2载体连接构建pCMV-tag-RT载体,随后以pCMV-tag-RT载体为模板扩增含有Flag标签的HBVRT区段基因酶切后与腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV连接,将其在Bi5183细菌中与腺病毒骨架载体重组,获得的重组质粒转染到Ad293细胞中包装,待细胞裂解后收集含病毒的上清并感染Huh7细胞,48h后抽提细胞总RNA通过RT-PCR鉴定目的基因转录。11、利用杆状病毒系统表达重组HBV聚合酶RT区段研究:采用PCR方法从pUC19-1.24HBV质粒中扩增RT/RNaseH区段,构建含有HBVP基因RT区段的杆状病毒穿梭载体pFastBacHT-RT,转化大肠埃希菌DH10Bac与杆状病毒骨架质粒进行重组,提取重组Bacmid DNA质粒,转染昆虫细胞Sf9获得含有HBV P基因RT区段的重组杆状病毒。重组的杆状病毒再感染Sf9细胞48小时后收集细胞,利用针对载体自身携带的His标签的抗体通过Western blot检测表达情况。12、研究HBV P基因RT区段对APOBEC3G启动子的影响:将pCMV-tag-RT与pGL3-A3G载体共转染Huh7细胞,同时以pCMV-tag与pGL3-A3G共转染做为阴性对照。转染后48小时收集细胞,检测双萤光素酶活性。13.用SPSS13.0统计学软件包进行统计学处理,两组均数比较用独立样本t检验,多组比较采用完全随机设计方差分析(One-wayANOVA),多重比较采用LSD检验,P＜0.05具有统计学意义。结果1、通过在线对APOBEC3G启动子进行分析结果显示有大量潜在的的转录因子结合位点,我们选择USF1基因做为研究对象来进行验证。2、pcDNA3.1(+)-USF1载体构建:经过测序后与UCSC上的标准序列比对证明pMD-USF1序列是正确的。酶切以及PCR鉴定pcDNA3.1(+)-USF1载体构建成功,转染Huh7细胞后western blot可见在34KD处有明显特异条带,证明我们所构建的pcDNA3.1(+)-USF1载体可以表达USF1蛋白。3、过表达USF1基因对APOBEC3G mRNA的影响:在瞬时转染pcDNA3.1(+)-USF1基因的Huh7细胞中APOBEC3G的mRNA表达水平是转染了pcDNA3.1(+)质粒的对照组的两倍左右。在稳定表达pcDNA3.1(+).USF1的Huh7细胞系中APOBEC3G的mRNA水平是pcDNA3.1(+)对照组的1.7倍。4、降低USF1基因表达对APOBEC3G的影响:通过转染将USF1基因的小干扰RNA转染到Huh7细胞中,western blot检测USF1的表达显示转染了USF1小干扰RNA片段转染Huh7细胞后USF1与对照组相比的表达降低,而做为内参的GAPDH则基本一致。Real-time RT-PCR检测结果显示APOBEC3G的表达比对照组降低约30%。5、USF1基因对APOBEC3G启动子的影响:双萤光素酶报告基因检测结果表明在Huh7和HepG2细胞中萤光素酶的活性与转染了空质粒的对照组相比都可以升高约5倍((t＝-40.476,P＝0.000;t＝-42.960,P＝0.000)。说明USF1基因在不同的肝细胞中均可以激活APOBEC3G启动子的转录。不同量的USF1基因转染结果表明,萤光素的活性随着USF1的表达增强而增强,提示USF1基因表达增强APOBEC3G启动子活性也相应的增强(F＝204.750,P＝0.000)。6、确定USF1基因在APOBEC3G启动子上的作用位点:对APOBEC3G启动子全长进行分析显示,APOBEC3G启动子上共有四处E-box位点,分别位于-1439/-1434、-757/-752、-288/-283和.91/-86,PCR扩增后通过酶切和测序鉴定证实一系列的5’端截短的APOBEC3G启动子报告基因构建成功,转染Huh7细胞后检测萤光素酶活性结果表明,随着截短的片段越短,启动子的活性越弱。转染了USF1基因组与对照组相比较,当截短到-159位点的时候USF1基因仍然可以激活APOBEC3G的表达(t＝-96.058,P＝0.000),当截短至-84位点时转染pcDNA3.1(+)-USF1和pcDNA3.1(+)质粒的两组萤光素酶活性基本相同(t＝-1.482,P＝0.213)。7、观察USF1对定点突变E-box后的APOBEC3G启动子影响:对pGL3-A3Gmut测序证实-91/-86位点CAGCTG成功突变为CAATTG,随后的转染结果表明在Huh7细胞中,USF1基因对pGL3-A3Gmut载体无激活作用,从而证实USF1通过对-91/-86位点CAGCTG起作用而激活APOBEC3G的转录(F＝1833.717,P＜0.001)。8、研究HBV对APOBEC3G启动子影响:pUC19-1.24HBV与pGL3-A3G共转染后检测萤光素酶活性显示,对照组的萤光素酶活性是转染了HBV组的4倍左右(t＝-13.335,P＝0.000)。HBV明显抑制了APOBEC3G启动子的活性。9、确认可能与AOPBEC3G启动子作用的病毒蛋白:转染了大S抗原、核心抗原和E抗原的各组萤光素酶的活性并没有明显升高(F＝2.878,P＝0.103),说明大S抗原,核心抗原和E抗原并不会影响APOBEC3G启动子的活性。10、利用腺病毒系统表达重组HBV聚合酶RT区段研究:成功扩增HBV RT区并克隆到pCMV-Tag2载体,成功将带有Flag标签的HBV RT区克隆到穿梭载体,并与腺病毒骨架质粒重组成功,转染ad293细胞成功包装成病毒颗粒,病毒颗粒感染Huh7细胞后RT-PCR能在Huh7细胞中检测到HBV RT区段mRNA转录。11、利用杆状病毒系统表达重组HBV聚合酶RT区段研究:成功扩增HBV RT区并克隆到pFastBacHT载体,在DH10Bac细菌中与杆状病毒骨架质粒重组成功,转染Sf9细胞后成功包装出杆状病毒颗粒,随后再感染Sf9细胞,利用抗His抗体通过western blot检测可以见到特异的条带,证实HBV RT区段可以表达。12、研究HBV P基因RT区段对APOBEC3G启动子的影响:HBV P基因RT区段与pGL3-A3G共转染后检测萤光素酶活性显示HBV P基因RT区段组与对照组相比较萤光素酶的活性无明显差别(t=-0.404,P=0.707),说明HBV P基因的RT区段并不影响APOBEC启动子的活性。结论1、在肝细胞中USF1基因参与APOBEC3G基因的基础转录调节,USF1可能通过与APOBEC3G转录起始位点上游-91/-86相作用而激活APOBEC3G的转录。2、HBV可以抑制APOBEC3G启动子的活性,但是大S抗原、核心抗原、e抗原和HBV聚合酶RT区段对APOBEC3G无抑制作用。