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第一部分:SOX9对ADAMATS-4/-5的调节作用及相关性研究研究背景:下腰痛已经成为全球继缺血性心脏病、脑血管病变及下呼吸道感染以后第四大导致健康寿命损失的疾病,其最常见的原因就是椎间盘退变。椎间盘退变是以内环境的改变和细胞及细胞外基质的数量、功能的改变为特点的,具体的表现为椎间盘内髙渗、低氧的内环境发生改变,髓核细胞数量的下降和功能的严重丧失,此外细胞外基质成分如聚蛋白聚糖、II型胶原等成分的数量减少,最终使得椎间盘内静态压发生改变,椎间盘不能维持原有高度和强度,丧失应有的生物力学功能。目前,对于椎间盘退变导致的腰痛的治疗手段都是以缓解患者的疼痛及神经压迫症状为目的,但并不能从根本上阻止椎间盘退变的发生、发展。为了能够从根本上解决椎间盘退变的问题,人们开始尝试生物治疗手段。SOX9是SOX基因家族（决定性别的基因,sex-determining region of Y chromosome,SRY）中E亚族中重要的成员,参与软骨的发育,调控细胞外基质成分如Ⅱ型胶原蛋白和聚蛋白聚糖的表达。已有研究证实,缺失或错配的SOX9基因会导致软骨发育不良综合症（CD综合症）,表现为长干骨的畸形弯曲,巨大颅骨,胸廓窄小等。SOX9基因还跟关节退变的发生、发展和转归有关系。有研究证实SOX9的表达量随骨性关节炎程度的加重而下降,这可能与SOX9调控的细胞外基质的降解有关系。骨关节炎与椎间盘退变的表现形式相似都是以细胞外基质的降解为特点,所以我们设想SOX9基因应该在椎间盘组织中也有类似的作用,而且目前已有研究证实,SOX9基因在退变椎间盘中的表达异常,但机制尚不清楚。ADAMTS（A disintegrin like and metalloproteinase with thrombospondin type I motifs）是一种含有血小板反应蛋白的分解蛋白和金属蛋白酶,ADAMTS-4和ADAMTS-5又称聚蛋白聚糖酶是ADAMTSs家族中的一份子,它们的主要生理作用就是降解聚蛋白聚糖。两者在椎间盘的退变中起到重要的作用。SOX9基因和ADAMTS-4及ADAMTS-5的作用底物都是细胞外基质成分,以聚蛋白聚糖和II型胶原蛋白为主,同时三者在退变椎间盘中的表达均有异常。他们三者在退变椎间盘组织中的关系尚不清楚,而且三者在椎间盘退变中的作用也尚未有报道。本次实验首次检测了不同程度退变的椎间盘中SOX9、ADAMTS-4、ADAMTS-5及聚蛋白聚糖的表达量,阐明它们之间的相互关系及在椎间盘退变中的意义。目的:探讨不同退变程度的椎间盘中SOX9、ADAMTS-4、ADAMTS-5及聚蛋白聚糖的表达量的变化,研究SOX9对ADAMTS-4和聚蛋白聚糖的具体调节作用。方法:人椎间盘组织标本取自腰椎后路手术的患者,按照Priffmann椎间盘影像学分级法,将人椎间盘组织按照1-5级分类。在临床就诊的病人中,使用Pfirrmann磁共振分级法将人不同退变等级的椎间盘组织进行区分。患者术后标本,按照此分别分为轻度退变组（Pfirrmann1-2级,n=10）,中度退变组（Pfirrmann3级,n=10）,重度退变组（Pfirrmann4-5级,n=10）。对各组组织液氮研磨后,使用组织RNA抽提试剂盒进行RNA抽提,使用real-time RT-PCR技术对各组样本中SOX9、Aggrecan、ADAMTS-4/-5的表达进行检测。将各组组织使用4%多聚甲醛进行固定、脱水、石蜡包埋后,进行组织切片,采用免疫组织化学染色法直观检测各组中SOX9、Aggrecan、ADAMTS-4/-5存在的情况。采集Q-PCR数据以及免疫组化量化结果,采用线性回归分析SOX9基因与Aggrecan、ADAMTS-4/-5之间相关性,明确SOX9基因在椎间盘退变过程中的可能作用。使用SOX9功能获得与缺失实验研究其对ADAMTS-4/-5的表达调控作用。采用瞬时质粒转染的方法进行具体的机制研究。大鼠髓核细胞瞬时转染采用经Dual-Luciferase Reporter Assay system。获取3.5kb ADAMTS-4/-5启动子质粒,将其插入PGL3-basic质粒中,构建完成PGL3-ADAMTS-4 promoter质粒。将其与SOX9过表达质粒共转染大髓核细胞48h后读取萤火虫荧光与海肾荧光比值,在启动子水平验证SOX9过表达情况对ADAMTS-4/-5的调控作用。筛选出SOX9基因表达的干扰序列,合成SOX9基因干扰质粒（sh-SOX9）,验证SOX9表达干扰效率,取达到60%干扰效果以上的质粒,将其与PGL3-ADAMTS-4/-5 promoter质粒共转染大鼠髓核细胞,验证SOX9沉默后,ADAMTS-4的表达情况。构建si SOX9、si ADAMTS-4和si ADAMTS-5慢病毒载体,将ADAMTS-4、ADAMTS-5 si RNA分别与SOX9 si RNA共同转入髓核细胞,48h后通过western blot实验检测髓核细胞内聚蛋白聚糖（aggrecan）蛋白表达及条件培养基中聚蛋白聚糖分解产物ARGSVIL蛋白的表达变化。结果:随着退变等级的升高,ADAMTS-4和ADAMTS-5表达上升（p＜0.05）,而细胞外基质成分聚蛋白聚糖（aggrecan）表达逐步下降（p＜0.05）,此外,转录因子SOX9的表达与椎间盘退变等级呈负相关,与aggrecan表达呈正相关;构建SOX9干扰和过表达质粒,分别将SOX9干扰和过表达质粒转染髓核细胞,结果显示抑制SOX9表达可在m RNA及蛋白水平均显著上调ADAMTS-4（p＜0.05）、ADAMTS-5（p＜0.05）的表达;过表达SOX9可引起ADAMTS-4（p＜0.05）、ADAMTS-5（p＜0.05）表达显著下调;SOX9对aggrecan在m RNA水平的表达无显著影响（p＞0.05）,但在蛋白水平发挥显著负性调节作用（p＜0.05）。过表达SOX9表达导致条件培养基中ARGSVIL含量显著下降（p＜0.05）,而干扰SOX9的表达可显著上调条件培养基中ARGSVIL含量（p＜0.05）。双荧光素酶报告基因（Luciferase assay）实验检测SOX9对于ADAMTS-4、ADAMTS-5启动子活性影响。结果显示,SOX9干扰质粒可显著上调ADAMTS-4、ADAMTS-5启动子活性（p＜0.05）;SOX9过表达质粒可显著下调ADAMTS-4、ADAMTS-5启动子活性（p＜0.05）。将ADAMTS-4 si RNA、ADAMTS-5si RNA分别与SOX9 si RNA共同转入髓核细胞,48h后通过western blot实验检测髓核细胞内aggrecan蛋白表达及条件培养基中ARGSVIL蛋白的表达变化。结果显示,与对照组相比,单纯抑制SOX9表达,细胞中aggrecan蛋白表达显著下降（p＜0.05）,条件培养基中ARGSVIL蛋白显著上升（p＜0.05）;同时干扰SOX9和ADAMTS-4、ADAMTS-5的表达后,与单纯干扰SOX9相比,细胞中aggrecan含量显著上调（p＜0.05）,条件培养基中ARGSVIL蛋白显著下调（p＜0.05）。结论:1.SOX9在退变的椎间盘中的表达减少,且与ADAMTS-4/-5呈负相关,与aggrecan表达呈正相关;2.SOX9可在m RNA和蛋白水平对ADAMTS-4、ADAMTS-5均有负向调节作用;3.SOX9对aggrecan有正向调节作用,但这种调节作用仅发生在蛋白水平;4.SOX9是通过ADAMTS-4、ADAMTS-5的表达进而调节髓核细胞内aggrecan的降解活性。第二部分:SOX9对ADAMTS-4/-5调控的机制研究及动物实验研究背景:近些年来,随着对椎间盘退变机制的深入研究,人们越来越认识到细胞外基质的合成和降解与椎间盘退变关系密切。目前研究的各种与椎间盘退变相关的基因或细胞因子,大部分最后都会直接或间接影响细胞外基质成分的降解或生成,从而对椎间盘产生影响。SOX9基因还能够调节软骨细胞和髓核细胞中细胞外基质成分的表达量,影响关节和椎间盘退变。ADAMTS-4和ADAMTS-5有降解聚蛋白聚糖的作用,在椎间盘退变中起到重要作用。前一部分实验,我们发现SOX9的表达量和聚蛋白聚糖的含量与椎间盘退变程度呈负相关,ADAMTS-4/-5与椎间盘退变程度呈正相关,SOX9可调节聚蛋白聚糖、ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达量。我们的实验也证实了SOX9是通过ADAMTS-4和ADAMTS-5来影响聚蛋白聚糖的含量。但是,目前尚没有研究阐述在退变的髓核细胞中SOX9与ADAMTS-4和ADAMTS-5的具体调控机制。因此,我们实验就是针对SOX9与ADAMTS-4和ADAMTS-5的调节关系进行研究,阐述SOX9与ADAMTS-4和ADAMTS-5的具体调控机制,为将来延缓或治疗椎间盘退变提供分子实验依据和新的治疗策略。目的:研究SOX9在椎间盘退变中的作用机理,探讨SOX9对ADAMTS-4和ADAMTS-5的具体的调控机制,为下一步椎间盘退变的基因治疗提供实验依据。方法:首先使用JASPAR数据库对SOX9在ADAMTS-4/-5的启动子结合位点进行预测,然后进行CHIP实验,观察SOX9在ADAMTS-4和ADAMTS-5的启动子片段上是否有富集,确定SXO9对ADAMTS-4/-5的启动子是否有作用。然后,我们分别使用SOX9过表达和si-SOX9质粒转染髓核细胞,使用western blot检测LC3的表达情况,检测SOX9是否可以诱导自噬。分别使用自噬抑制剂和激动剂观察ADAMTS-4/-5的表达情况,确定自噬对ADAMTS-4/-5的影响。进行动物实验,构建SOX9椎间盘条件敲除小鼠:将SOX9flox/flox小鼠与被Col2a1启动子驱动的Cre转基因小鼠（Col2a1Cre）进行繁衍最终得到Col2a1Cre-Sox9 KO小鼠（Col2a1Cre;Sox9f/f）。继续饲养Sox9 KO小鼠,在8周处死小鼠,获取小鼠脊柱标本。使用组织病理学（HE染色,番红O染色,Masson染色,免疫组化）对小鼠IDD的程度进行检测。在4周时于小鼠尾椎内注射200微升自噬激动剂（雷帕霉素）,8周时通过Western blot及RT-PCR实验检测椎间盘退变指标表达差异。结果:CHIP实验显示:SOX9在ADAMTS-4和ADAMTS-5的启动子片段上均未见到明显的富集;SOX9过表达后LC3-II显著升高,而SOX9被抑制后LC3-II水平显著降低,说明SOX9可以激活自噬。使用自噬抑制剂干预髓核细胞后,ADAMTS-4/-5的表达显著增加,而使用自噬激动剂ADAMTS-4/-5的表达显著降低,说明自噬可以负性调节ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达量;动物实验结果显示SOX9椎间盘条件敲除小鼠（KO）较野生型小鼠椎间盘发生显著退变,且椎间盘内aggrecan及COL2α1表达显著下降,而ADAMTS-4/-5表达显著上升;相较于对照组,雷帕霉素的注射使SOX9椎间盘条件敲除小鼠（KO）椎间盘退变情况得到显著缓解,且aggrecan的表达显著上调,ADAMTS-4/-5表达显著下降,说明自噬缓解了SOX9缺失对椎间盘的影响。结论:SOX9在髓核细胞中通过介导自噬在转录水平负性调节ADAMTS-4、ADAMTS-5的表达,进而影响细胞外基质及组织中aggrecan含量,最终在体内发挥保护椎间盘的作用