研究背景:结直肠癌的发生是一种多步骤、多因素复杂作用的结果,每年结直肠癌新发病例和死亡病例均位列癌症总数的第五位,并且具有逐年上升趋势。大多数早期患者无明显症状,或者仅有轻微的腹痛、腹胀等不适;当出现明显症状时,已是中晚期,甚至失去手术机会。因此,深入研究结直肠癌发生发展中的具体机制,寻找临床诊断和治疗新靶点,有利于提高结直肠癌患者无病生存率和总生存率。以往研究显示,WWP1包含三种的结构域,即WW结构域、E6AP羧基末端结构域以及N末端C2结构域。目前的研究显示其与许多肿瘤的发展有紧密联系,包括在胃癌,肝癌、前列腺癌和乳腺癌的发生发展过程中作为启动因素或者调控因素中具有关键的作用,因而可能成为肿瘤分子治疗的潜在靶点。那么,WWP1在结直肠癌中是否具有促癌作用,其具体分子机制又是如何?国内外尚无相关文献报道。研究目的:越来越多的证据显示,WWP1的表达异常在机体许多恶性肿瘤的发生发展过程中中扮演着重要角色。本实验拟通过临床标本,细胞实验以及动物实验等三个水平中探讨WWP1作为结直肠癌标记物对患者临床特征及生存期的预测能力,以及深入研究WWP1在结直肠癌细胞增殖、迁移以及侵袭过程中的作用和可能的相关调控机制。研究方法:首次,在临床水平上,课题组利用实时定量荧光PCR、Western blot以及免疫组化等方法验证WWP1在结直肠癌组织和对应的癌旁组织中的m RNA和蛋白表达水平变化,并运用生物信息学以及统计分析结直肠癌患者组织中WWP1表达水平的高低与临床资料的相关性,并分析WWP1高表达的结直肠癌患者预后情况;其次,在细胞水平上,质粒或小干扰RNA过表达或者特异性敲低结直肠癌细胞系中WWP1基因的表达水平,并验证其转染效率,通过CCK8实验、细胞划痕实验以及Transwell实验检测WWP1对结直肠癌细胞增殖情况、迁移能力和侵袭能力的影响,以及Western blot检测WWP1对PTEN/Akt信号通路的影响。最后,在动物水平上,构建HCT116细胞系中WWP1特异性敲低的慢病毒,随机将裸鼠分为实验组和对照组,然后在裸鼠右侧背部皮下接种2X10~6细胞/只。当肿瘤体积生长至55-80mm~3时,实验组组每3天注射一次WWP1 si RNA,对照组注射无功能的si RNA,观察肿瘤大小和体积变化,并运用生存曲线Kaplan-Meier来分析移植瘤裸鼠的生存率与WWP1的表达水平的相关性。研究结果:我们首先利用GEO结直肠癌数据库发现,WWP1 m RNA在结直肠癌组织中呈现高表达状态;接着,实时定量荧光PCR、Western blot和免疫组化分析发现发现,WWP1 m RNA和蛋白在结直肠癌组织中表达水平比正常组织明显升高,差异具有统计学意义,这与上述数据库结果相一致,说明在CRC中WWP1在转录和翻译水平都发生了变化;采用卡方检验进行的相关性分析表明,WWP1的表达水平与肿瘤大小,CEA水平,肿瘤浸润深度;远处转移以及TNM分期呈正相关性;同时,Kaplan-Meier生存曲线以及log-rank分析表明,WWP1在结直肠癌组织表达水平越高,患者预后越差;单因素和多因素分析表明,WWP1的表达水平可以作为结直肠癌预后评估的危险因素之一。再次,体外CCK8增殖结果显示,WWP1基因的过表达可增强结直肠癌细胞的增殖能力,而敲低WWP1基因时,CRC细胞的增殖能力明显下降。同样,在细胞划痕实验及侵袭实验中也证实,过表达WWP1基因的结直肠癌细胞系的迁移和侵袭能力明显增强;敲低WWP1基因时,CRC细胞迁移和侵袭能力明显降低。通过Western blot实验结果,我们发现WWP1可能通过PTEN/Akt信号通路来影响结直肠癌细胞发生发展。最后,通过结直肠癌皮下移植瘤实验发现,与对照组相比,发现实验组裸鼠肿瘤的生长显著被抑制,且差异具有统计学意义;Kaplan-Meier存活曲线分析结果显示,实验组中裸鼠的生存时间显著延长。研究结论:在临床水平上WWP1 m RNA和蛋白在结直肠癌组织中表达量明显增高;在细胞水平上,WWP1可以促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;并通过PTEN/Akt信号通路促进结直肠癌细胞的发生发展;在动物水平上,WWP1表达下调可以抑制结直肠癌裸鼠移植瘤的大小,为开辟结直肠癌患者临床治疗新靶点提供可靠的实验依据。