【摘 要】
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目的:探索褪黑素（Melatonin,Mela）是否可以在肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）诱导的炎性微环境下保护人牙周膜干细胞（human Periodontal ligament stem cells,h PDLSCs）的成骨潜能并减少活性氧的产生,初步探求其潜在的机制,为褪黑素作为治疗牙周炎的候选药物提供理论依据。方法:（1）刮取牙根中1/3的牙周
【基金项目】
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国家自然科学金（81460104）,“IL-35（iTr35）在口腔扁平苔藓Th17/Treg平衡中的作用”；
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目的:探索褪黑素（Melatonin,Mela）是否可以在肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）诱导的炎性微环境下保护人牙周膜干细胞（human Periodontal ligament stem cells,h PDLSCs）的成骨潜能并减少活性氧的产生,初步探求其潜在的机制,为褪黑素作为治疗牙周炎的候选药物提供理论依据。方法:（1）刮取牙根中1/3的牙周膜组织,利用组织块酶消化法分离培养原代h PDLSCs,采用流式细胞术检测细胞表面抗原CD146、CD90、CD45的表达及成骨成脂诱导分化检测其多向分化能力;（2）采用碱性磷酸酶活性分析检测不同浓度褪黑素对炎性微环境下h PDLSCs成骨分化能力的影响,确定最适浓度;根据结果将实验分为三组:对照组（仅含成骨培养基）、TNF-α组（成骨培养基+10ng/ml TNF-α）、TNF-α+Mela组（成骨培养基+10ng/ml TNF-α+100μM褪黑素）;（3）采用碱性磷酸酶染色及活性分析、茜素红染色及半定量分析、RT-q PCR及蛋白质印迹法检测成骨相关基因和蛋白（OPN和RUNX2）的表达,观察褪黑素对炎性微环境下h PDLSCs成骨分化能力的影响;（4）使用荧光显微镜及流式细胞术观察h PDLSCs细胞内ROS水平,RT-q PCR及蛋白质印迹法检测氧化酶和抗氧化酶相关基因和蛋白（NOX1和CAT）的表达水平,观察褪黑素对炎性微环境下h PDLSCs氧化应激的变化;（5）蛋白质印迹法检测褪黑素对炎性微环境下h PDLSCs的NF-κB信号通路相关蛋白P65/P-P65、IκBα表达情况。结果:（1）流式细胞术结果显示,本实验培养的h PDLSCs表面标记物CD90和CD146的表达率分别为99.6%、63.7%,而CD45表达率仅为0.27%,且具有成骨、成脂分化能力,符合间充质干细胞典型特征,结合取材部分,说明本实验提取的细胞是人牙周膜干细胞;（2）100μM褪黑素可最大程度恢复炎性微环境下h PDLSCs碱性磷酸酶活性,故选择此浓度进行后续实验;（3）选择TNF-α刺激h PDLSCs后,碱性磷酸酶染色程度及活性下调,茜素红染色及半定量分析显示矿化形成减少,同时OPN和RUNX2的基因和蛋白表达水平降低,而褪黑素可以部分恢复TNF-α抑制的h PDLSCs成骨潜能（P＜0.05）;（4）褪黑素可以降低炎性微环境下的ROS水平,并下调氧化酶NOX1、上调抗氧化酶CAT的表达（P＜0.05）;（4）蛋白质印记法结果显示,TNF-α组p65蛋白的磷酸化水平上调、IκBα蛋白水平下调,而TNF-α+Mela组p65蛋白的磷酸化水平下调,IκBα蛋白水平上调（P＜0.05）。结论:褪黑素可以抑制炎性微环境下h PDLSCs成骨分化过程中的ROS的产生,并体外逆转TNF-α抑制的h PDLSCs成骨分化的作用,这个过程伴随着NF-κB信号通路的激活和失活。因此,这些发现提供了更多的证据表明褪黑素可以用作h PDLSCs骨再生治疗牙周炎的候选药物。
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