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副溶血性弧菌（Vibrio.parahaemolyticus）是一种食源性致病菌,广泛分布在沿海地区。V.parahemolyticus是人们在食用处理不当的海产品后引发肠胃炎的主要致病因素。V.parahaemolyticus易在食品加工设备中形成生物被膜,从而产生较好的耐药性。因此,食品领域急需开发一种高效杀灭V.parahaemolyticus并根除其生物被膜的技术手段。近年来,光动力灭活（PDI）技术是逐渐兴起的一项非热加工技术,PDI是在光、光敏剂以及溶解氧同时存在的情况下发生的光化学反应,可以高效、快速杀死食源性致病菌。本课题组常年从事酚酸类衍生物对各类食源性有害菌的抑制活性与机制的相关研究。在此基础上,本研究首次证实了没食子酸辛酯（OG）是一种兼具抑菌特性以及光敏特性的食品添加剂,针对V.parahemolyticus及其生物被膜开发出了一种高效杀灭与清除技术,即OG与420 nm蓝光（BL）相结合的PDI技术。同时,本研究深入阐明了OG介导的PDI技术对V.parahemolyticus的抑菌机制。首先,本研究考察了OG介导的PDI技术对V.parahaemolyticus的抑菌活性。通过测定不同烷基链长的没食子酸烷基酯（GACs）对V.parahaemolyticus的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）,研究发现没食子酸辛酯（OG）对V.parahaemolyticus的MIC以及MBC值分别为0.05 m M、0.1 m M,表明OG具有最优的抑菌活性。因此,选择OG作为光敏剂,继续考察OG与BL相结合后对V.parahaemolyticus的抑菌活性,结果发现在0.2 m M OG与420 nm BL的协同作用15 min后（光剂量为191.7 J/cm~2）,V.parahaemolyticus的活菌数降为0 Log CFU/m L,该实验现象表明OG介导的PDI技术可以高效地将V.parahaemolyticus完全杀死。其次,本研究继续考察了OG介导的PDI技术对V.parahaemolyticus的抑菌机制。通过荧光探针二苯硼酸-2-氨基乙酯（DPBA）摄取实验可知,经过OG介导的PDI处理后的细胞荧光强度（536.5±56.0）远远高于经没食子酸（GA）介导的PDI实验组的荧光强度（114±9.1）,表明与GA相比,OG与细菌之间具有更好的亲和性,细菌细胞内对OG的摄取水平是导致V.parahaemolyticus被杀死的关键因素。接下来,利用2’,7’-二氯荧光素二醋酸酯（DCFH-DA）探针以及激光共聚焦（CLSM）实验,对V.parahaemolyticus细胞内活性氧（ROS）的产生水平进行了评估,结果发现经OG介导的PDI处理后的V.parahaemolyticus细胞内ROS的荧光强度最高（1005.27）以及共聚焦图像中的荧光数量最多,表明ROS的生成在杀菌机制中起着重要作用。此外,还通过添加ROS清除剂鉴定了ROS的种类,发现在加入CAT、DMSO以及TEMPOL清除剂后,菌落数从0 Log CFU/m L都分别回升至2.2 Log CFU/m L、4.7 Log CFU/m L以及3.2 Log CFU/m L。此外,还通过羟基苯基荧光素（HPF）探针以及细胞流式技术对·OH的生成情况进行了分析,研究发现经过OG介导的PDI处理后的细胞·OH的荧光强度最高（～100000）以及细胞数量最多。这些实验现象都表明生成的ROS的种类主要为·O2-、·OH以及H2O2,其中·OH起着主要的杀菌作用。本研究继续通过QCM-D实验考察了与GA相比OG与细胞膜之间具有较好亲和性的主要原因,研究发现当GA与模拟膜作用时,f11值和D11值几乎不变,而OG与模拟膜作用时,f11值持续下降,D11值改变很小,该现象表明GA几乎不与细菌模拟膜相互作用,而OG可以通过跨膜插入的方式不断地进入脂质双层内部。之后,通过碘化丙啶（PI）摄取实验可知,研究发现经过OG介导的PDI处理后的细菌细胞内的PI的荧光强度最高（5901.6）,该实验现象表明OG的跨膜插入以及ROS的产生都会对细胞膜的完整性造成一定的伤害。根据DPBA以及PI摄取速率实验的结果可知,在低浓度OG（0.025 m M）与BL（106.5m W/cm~2）的协同作用下,细胞内对OG的摄入水平相当,然后细胞膜损伤水平出现明显差异性,该现象说明不仅胞内ROS以及OG的跨膜插入会破坏细胞膜,当OG插在细胞膜上时,在BL的照射下胞外也可能会产生ROS,从而对细胞膜的结构产生影响。通过SEM实验可知,经过OG和BL协同处理后的细菌形状变得不规则,细菌表面变得粗糙,甚至出现破碎菌体,更直观地证明OG介导的PDI会对细胞膜造成明显破坏。然后,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实验研究发现经过OG介导的PDI处理后的V.parahaemolyticus膜蛋白条带颜色变深,甚至出现新的蛋白条带,该现象表明OD介导的PDI技术会导致细菌膜蛋白发生降解与聚集。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）对膜蛋白的结构进行了进一步的分析,发现经过OG与BL协同处理后的膜蛋白的二级结构发生了改变,表明在BL的照射下,OG与膜蛋白之间会发生化学作用。此外,通过DNA凝胶电泳,研究发现经过OG与BL协同处理后,V.parahaemolyticus的DNA条带消失,表明OG介导的PDI技术会对V.parahaemolyticus的DNA基因的完整性起到破坏作用。还通过分子对接技术发现OG以及OG的氧化产物醌均可以与DNA之间通过氢键发生相互作用,OG与DNA最低结合能为-7.26 kcal M-1,此时包含了1个构象,醌与DNA最低结合能为-7.53 kcal M-1,此时包含了20个构象,实验结果表明OG和醌均能对DNA的结构产生重要影响,与OG相比,醌与DNA结合之后的构象也更加稳定,醌与DNA之间的相互作用更加强烈。之后,继续研究了OG介导的PDI对V.parahaemolyticus形成过程中以及成熟的生物被膜的影响。通过对生物被膜进行结晶紫染色并且测定OD600可知,48 h为V.parahaemolyticus生物被膜生长的最佳时刻(OD600=1.5633)。经过OG介导的PDI处理后的形成中的生物被膜以及成熟的生物被膜的生物量都会明显减少,在0.2 m M与106.5 m W/cm~2 BL协同处理30 min、60 min后,分别降低55.2%、84%。还通过CLSM对生物被膜的形态进行了观察,结果发现经过OG介导的PDI处理之后,形成中以及成熟的生物被膜都出现了结构不完整,表面凹凸不平的形态,以及生物被膜内部明显出现了大量死菌,这些实验现象都说明OG介导的PDI技术不仅可以有效防止V.parahaemolyticus生物被膜的形成,还对成熟的生物被膜具有清除作用。此外,本研究继续考察了经过OG介导的PDI处理后的生物被膜内部细菌的活性,结果发现生物被膜中的活菌数减少了2.54 Log CFU/m L,该实验现象表明OG介导的PDI技术对生物被膜内部的细菌也具有一定的杀灭效果。最后,制备含有OG的壳聚糖溶液,对三文鱼片进行涂抹。研究发现,12天时三文鱼表面的菌落数没有明显变化,大约为3.62 Log CFU/m L。此外,在15天时,三文鱼仍然保持原有的风味与色泽,说明OG可以有效抑制三文鱼片表面微生物的生长,具有对三文鱼片贮藏保鲜的应用潜力。