研究背景:肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,Mp）是引起人类呼吸道感染最常见的病原体。除引起儿童和成人的社区获得性肺炎（community acquired pneumonia,CAP）外,还可导致多种肺外疾病。肺炎支原体的基因组小、结构简单,其顶端结构（tip structure）上的P1蛋白主导着Mp在宿主细胞膜上的黏附与滑行,P1的缺失使得Mp失去致病性,因此,P1蛋白在Mp致病过程中的重要性不言而喻。然而,P1蛋白的受体及其与宿主细胞黏附的机制仍有疑议。本研究旨在筛选人支气管上皮细胞（BEAS-2B）膜中能与P1蛋白相互作用的蛋白,并验证其是否能作为黏附受体发挥相应作用。通过对受体蛋白的筛选与鉴定进一步了解Mp的致病机制,为Mp的防治提供新的思路。研究目的:通过改进的病毒铺覆蛋白印迹技术（VOPBA）筛选重组P1蛋白在BEAS-2B细胞膜上的互作蛋白,并验证其功能。为阐明Mp黏附机制及P1蛋白的功能提供依据。研究方法:1.构建rP1-C/p ET-30a（+）载体,原核表达纯化P1蛋白羧基端1,160-1,498位氨基酸残基,对洗脱液进行超滤浓缩后,BCA法检测重组P1蛋白（rP1-C）的浓度。2.制备rP1-C抗体:将rP1-C与弗氏佐剂混合,乳化后皮下注射免疫新西兰兔,心脏取血并用饱和硫酸铵法对血清进行初步纯化,随后使用结合了rP1-C的溴化氰活化琼脂糖4B（CNBr-activated Sephaose 4B）对抗体进行进一步纯化。3.提取细胞膜蛋白,并利用改良的VOPBA法和LC-MS质谱分析法筛选BEAS-2B细胞膜中能与rP1-C发生特异结合的蛋白,采用免疫印迹法（Western blotting,WB）对筛选出的蛋白进行验证,间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence,IIF）观察互作蛋白在细胞中的分布情况。4.进行Far-western blotting、间接酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）试验和双重免疫荧光试验,以证实rP1-C与目的蛋白间的相互作用。5.将Mp和rP1-C与目的蛋白预孵育,BEAS-2B细胞与目的蛋白抗体预孵育,以减少Mp和rP1-C与BEAS-2B的结合位点。激光扫描共聚焦荧光显微镜（LSCM）观察Mp和rP1-C对细胞的黏附是否受到目的蛋白及其抗体的影响。6.使用短干扰RNA（siRNA）转染细胞干扰目的蛋白在细胞中的表达,WB及实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测蛋白表达水平,LSCM观察Mp和rP1-C对细胞黏附量的改变。7.利用慢病毒载体CMV-GFP-puro-Vimentin构建目的蛋白过表达细胞株,WB及实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测蛋白表达水平,LSCM观察Mp和rP1-C对细胞黏附量的改变。研究结果:1.SDS-PAGE及WB结果显示在分子量约为43k Da处出现明显条带,表明成功表达并纯化了rP1-C,BCA测定结果表明其浓度达1.5mg/m L。2.SDS-PAGE及WB结果显示,在分子量约为50 k Da和25 k Da处出现了明显条带,分别为多克隆抗体的重链和轻链,表明成功制备了兔源rP1-C多克隆抗体。3.经改良的VOPBA法和LC-MS质谱分析,波形蛋白（Vimentin）和β-4微管蛋白（beta-4 Tubulin）得分最高,最可能是rP1-C的互作蛋白,Vimentin和beta-4 Tubulin主要分布在细胞的胞质及胞膜上。4.rP1-C能够与Vimentin发生特异性结合,但与beta-4 Tubulin的结合不明显。5.Vimentin预孵育组以及Vimentin抗体预孵育组中Mp和rP1-C对细胞的黏附量显著减少,表明Vimentin确实与Mp和rP1-C对细胞的黏附有关。6.Vimentin-siRNA转染BEAS-2B细胞后,Vimentin在细胞中的表达显著减少,Mp和rP1-C对细胞的黏附量明显减少,表明Vimentin在Mp和rP1-C对细胞的黏附过程中发挥着不可或缺的作用。7.成功构建了BEAS-2B-Vimentin过表达细胞株,Vimentin的表达量明显增加,Mp和rP1-C对细胞的黏附量也相应增加,表明Vimentin确实可作为Mp的黏附受体发挥作用。结论:Mp P1蛋白可能以细胞膜中的波形蛋白为黏附受体,黏附于人支气管上皮细胞表面。