论文部分内容阅读
目的：探讨脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, AMSC)联合类内皮细胞(endothelial-like cell, ELC)或人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cell, HUVEC)移植对糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)大鼠的血-视网膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)的影响及作用机制；评价不同剂量的AMSC移植治疗DR大鼠的效果。方法：以链脲佐菌素腹腔注射法建立Wistar大鼠糖尿病动物模型。于注射后7个月(30周)时,随机抽选大鼠行视网膜血管网消化铺片以明确DR血管性损伤的发生。原代分离、培养AMSCs和HUVECs,流式细胞仪进行鉴定。将AMSCs置于内皮细胞培养基中诱导分化得到ELCs。DR大鼠随机分组：未治疗组、诱导组(AMSCs +ELCs)、联合组(AMSCs+HUVECs)、高剂量组(AMSCs)及低剂量组(AMSCs),经尾静脉注射行细胞干预。于干预后2、4周,Evans blue渗漏实验评估大鼠的BRB功能；HE染色评估大鼠视网膜水肿度；qPCR及Western-blot检测大鼠视网膜细胞间黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、促血管生成素-2(angiopoietin-2, Ang-2)的表达；免疫组织化学及共聚焦荧光染色观察移植细胞向视网膜的归巢；心、肝、脾、胰、肾的HE及免疫组织化学染色评估细胞移植的安全性。结果：1)DR模型：7个月时,糖尿病大鼠的视网膜血管网消化铺片可见闭锁的无细胞性毛细血管,DR大鼠模型建成。2)细胞培养：原代培养的AMSCs及诱导而来的ELCs均为成纤维细胞样。原代培养的HUVECs为铺路石样排列的多角形细胞,高表达内皮细胞标志分子CD31(99.52%)和vWF(99.63%)。3) BRB功能试验：干预后2周,与未治疗组相较,仅诱导组及低剂量组的Evans blue渗漏量有所减轻,BRB功能有改善。干预后4周,其余各干预组的BRB功能均较诱导组的为好。3) 分子表达：干预后2周,与未治疗组相较,仅低剂量组的ICAM-1蛋白水平有所下降；诱导组的ICAM-1及VEGF的基因转录转录及蛋白表达均有所上升；各组之间Ang-2的基因转录及蛋白表达均无统计学差异。干预后4周,与未治疗组相较,各干预组的ICAM-1蛋白表达均有所下降；低剂量组的VEGF的基因转录水平有所上升,但VEGF蛋白表达有所下降；诱导组的VEGF的基因转录水平有所上升,蛋白水平无明显变化；各组之间Ang-2的基因转录及蛋白表达水平均无统计学差异。4)视网膜结构：标化灰度值分析结果示,干预后2周,与未治疗组视网膜对应层次对比,仅低剂量组的外核层和视网膜神经纤维层水肿度有所减轻。干预后4周,与未治疗组视网膜对应层次相较,各干预组的外核层、除外诱导组的各干预组的内核层、联合组及高剂量组的内丛状层的水肿度均有所减轻。5)细胞归巢：免疫组织化学染色及共聚焦结果示,人源细胞在视网膜上散在分布,可能与视网膜血管有密切关系。6)移植安全性：HE染色镜下可见糖尿病肾病改变及肾脏多发肿瘤。仅联合组可以见到大量肾小管细胞管型。胰腺的胰岛细胞数目有所减少。心、肝、脾的结构大致正常。免疫组化结果示人源细胞密集于大鼠的脾脏和肾脏肿瘤周围,可见于肝脏汇管区,偶见于肾小管管壁和联合组的肾小管管腔。结论：AMSCs能够改善DR大鼠的BRB功能,该作用可能是通过抗炎作用来实现。单纯低剂量AMSCs治疗组能够更快改善DR大鼠的BRB功能。单纯AMSCs注射治疗DR的效果优于联合ELCs组。