植物病原细菌的三型分泌系统(TTSS)是丁香假单胞菌(Pseudomonaa syringae)侵染过程中重要的蛋白分泌系统。TTSS的编码、蛋白分泌等受到hrp基因的调节。研究hrp基因在病菌侵染过程中的表达情况有助于进一步探索hrp基因的功能,揭示植物病原细菌的分子致病机制,而egfp标记突变体的构建是开展寄主.病原物的互作研究的重要策略。　　 本试验拟以增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)作为报告基因,以植物丁香假单胞菌烟草致病变种和番茄致病变种为材料,以其hrpA基因和hrpZ基因为靶标,通过体外重组和双亲结合技术,分别构建靶标基因与egfp融合表达的突变体,以及靶标基因缺失的egfp标记突变体,为今后研究丁香假单胞菌.植物的互作提供有用的材料工具。主要试验结果为:　　 (1)以丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株和烟草致病变种4号菌株的基因组DNA为模板,扩增出hrpA、hrpZ基因及其上下游片段；以pEGFP-C1为模板扩增出了egfp ORF全长。将相关的DNA片段进行体外重组后,得到了4个与预期大小一致的目的大片段CDE3、CTE1、CTE3、CTE4,它们分别为hrpZPto::egfp、hrpAPsta::egfp、hrpZPsta::egfp融合型片段和ΔhrpZPsta::egfp缺失型片段,为下一步构建融合型、缺失型突变体的构建奠定了基础。　　 (2)试验将获得的目的大片段CDE3、CTE1、CTE3、CTE4分别连接至克隆载体pMD19-T,提取阳性克隆质粒pMD19-CDE3、pMD19-CTE1、pMD19-CTE3、pMD19-CTE4的DNA与自杀型质粒pKSM1的DNA同时进行BamHⅠ和XbaⅠ双酶切,切胶回收的酶切片段进行连接,得到了适于进行双亲接合所用的自杀型重组质粒pKSM-CDE3、pKSM—CTE1、pKSM-CTE3、pKSM—CTE4。　　 (3)将含有质粒pKSM-CDE3的大肠杆菌S17-1与番茄致病变种DC3000野生型菌株进行双亲接合后获得了hrpZPto::egfp融合型突变体；将含有质粒pKSM-CTE1、pKSM-CTE3、pKSM-CTE4的大肠杆菌S17-1分别与烟草致病变种4号菌野生型菌株进行双亲结合获得了hrpAPsta::egfp、hrpZPsta::egfp融合型突变体和ΔhrpZPsta::egfp缺失型突变体。将获得的4个突变体菌株划线于KB培养基(30μg/ml Nalr)上,在紫外灯下观察发现hrpAPsta::egfp融合型突变体有明显的绿色荧光,而hrpZPto::egfp,hrpAPsta::egfp融合型突变体及△hrpZPsta::egfp缺失型突变体则无绿色荧光。　　 (4)与野生型菌株相比,以上构建的4个egfp标记突变体人工接种烟草后,pv.tomatoDC3000的hrpZPto::egfp融合型突变体的过敏性诱导能力明显降低；hrpAPsta::egfp,hrpZPsta::egfp融合型突变体及ΔhrpZPsta::egfp缺失型突变体的致病性也明显降低。