论文部分内容阅读
目的:研究Caveolin-1/VEGF信号通路及Sema3A对大鼠星形胶质细胞OGD/R损伤的调节作用,探讨缺血再灌注损伤后神经功能受损的机制。 方法:购买大鼠星形胶质细胞株,传代培养,通过倒置光学显微镜观察细胞生长形态,适时冻存或传代。细胞分组:随机分为正常对照组、氧糖剥夺/复氧模型组(Oxygen glucose deprivation and reoxygenation,OGD/R)、小凹蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)基因沉默组、Cav-1基因沉默OGD/R组。对正常对照组的细胞常规培养;对OGD/R组,在对数生长期缺氧缺糖6h复氧24h建立OGD/R模型;对Cav-1基因沉默组,利用慢病毒载体包装的Cav-1 RNAi干扰细胞中的Cav-1建立Cav-1基因沉默模型;对Cav-1基因沉默OGD/R组,在Cav-1基因沉默的基础上再建立OGD/R模型。指标检测:CCK-8法检测细胞存活率,荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)法检测Cav-1、VEGF、Sema3A的mRNA的表达,免疫印迹(Western blot,Wb)法和免疫荧光法检测Cav-1、VEGF、Sema3A的蛋白的表达。 结果:⑴细胞株传代顺利,以1×106的细胞密度铺板,培养5h即贴壁生长,24h时呈现典型“铺路石”样形态,为对数生长期阶段,说明大鼠星形胶质细胞培养成功。⑵OGD/R组细胞存活率低于正常对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01),说明成功建立大鼠星形胶质细胞OGD/R模型。⑶基因沉默组的Cav-1mRNA表达、Cav-1蛋白表达均低于正常对照组,差异分别有统计学意义(P<0.05、P<0.01),说明成功建立Cav-1基因沉默模型。⑷Cav-1、VEGF、Sema3A的mRNA的表达:Cav-1mRNA表达分别与正常对照组比较,OGD/R组表达上升,Cav-1基因沉默组表达下降,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与OGD/R组比较,Cav-1基因沉默OGD/R组表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);VEGF mRNA表达分别与正常对照组比较,OGD/R组、Cav-1基因沉默组以及Cav-1基因沉默OGD/R组的VEGF mRNA表达均下降,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与Cav-1基因沉默组比较,Cav-1基因沉默OGD/R组表达下降,差异有显著统计学意义(P<0.01); OGD/R组与Cav-1基因沉默OGD/R组比较,VEGFmRNA表达无统计学差异(P>0.05);Sema3A mRNA表达与正常对照组比较,OGD/R组表达上升,差异有显著统计学意义(P<0.01)。⑸Cav-1、VEGF、Sema3A的蛋白表达。Wb法结果:Cav-1表达分别与正常对照组比较,OGD/R组表达上升,Cav-1基因沉默组表达下降,Cav-1基因沉默OGD/R组表达下降,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与OGD/R组比较,Cav-1基因沉默OGD/R组表达下降,差异有显著统计学意义(P<0.01);与Cav-1基因沉默组比较,Cav-1基因沉默OCD/R组表达上升,差异有统计学意义(P<0.05);VEGF表达分别与正常对照组比较,OGD/R组表达下降,Cav-1基因沉默组表达下降,差异均有显著统计学意义(P<0.01);Sema3A表达分别与正常对照组比较,OGD/R组和Cav-1基因沉默OGD/R组表达上升,差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光法结果:Cav-1表达分别与正常对照组比较,OGD/R组表达上升,差异有显著统计学意义(P<0.01);Cav-1基因沉默组表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与OGD/R组比较,Cav-1基因沉默OGD/R组表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与Cav-1基因沉默组比较,Cav-1基因沉默OGD/R组表达上升,差异有显著统计学意义(P<0.01);VEGF表达与正常对照组比较,OGD/R组表达下降,差异有显著统计学意义(P<0.01);Sema3A表达与正常对照组比较,OGD/R组表达上升,差异有统计学意义(P<0.05)。6.Cav-1与Sema3A的相关性: mRNA表达呈正相关(r=0.861,P<0.01,n=20),蛋白表达呈正相关(r=0.727,P<0.01,n=20)。 结论:①Caveolin-1是大鼠星形胶质细胞OGD/R损伤修复的重要上游信号。②Sema3A参与星形胶质细胞OGD/R细胞损伤过程,可能是导致脑缺血再灌注后神经受损的重要因子之一。