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目的:探讨自噬作用与血管平滑肌细胞(VSMC)增殖之间的关系。为防治VSMC异常增殖提供新的理论依据。实验方法:用健康SD大鼠的腹主动脉进行VSMC的原代培养,培养基选用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM,培养条件为5%CO2、37℃。培养3～5天有细胞爬出,7～9天左右可进行第一次传代。根据检测方法的不同可分为:①用于免疫细胞化学检测的细胞接种于放有小圆玻片的24孔板内,细胞按5×104个/ml细胞密度,每孔1ml。②用于免疫印迹检测的细胞接种于50ml培养瓶中,细胞按5×105个/ml细胞密度,每瓶3ml。实验选用3～6代VSMC,VSMC传代后静置培养16 h,等细胞完全贴壁后换用含0.5%FBS的DMEM培养24 h进行同步化处理(使所有细胞处于细胞周期的静止期),随后分为七个组:①对照组;②雷帕霉素(RPM)组(10 ng/ml);③3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(10 ng/ml);④凝血酶(F2)组(1 U/ml);⑤雷帕霉素(10 ng/ml)+凝血酶组(1 U/ml);⑥3-MA(10 ng/ml)+凝血酶组(1U/ml);⑦雷帕霉素(10 ng/ml)+胃酶抑素(Pep)组(0.01μmol/ml)。不同药物处理后继续培养48 h,通过免疫细胞化学、免疫印迹方法检测各组VSMC的增殖细胞核抗原(PCNA)和微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达变化。结果:一.自噬对VSMC增殖的影响实验分别用雷帕霉素和3-MA作用VSMC,用免疫细胞化学和Western Blot方法检测PCNA、LC3表达变化,结果表明:雷帕霉素作用VSMC后与对照组相比能明显抑制其增殖(P<0.01),而3-MA则促进VSMC增殖(P<0.01)。Western Blot检测PCNA蛋白表达结果进一步表明F2能促进平滑肌细胞的增殖,但与雷帕霉素共同作用时,F2的促平滑肌增殖作用大大降低(P<0.01),3-MA与F2共作用时有促VSMC增殖作用。二.增殖因素(F2)对VSMC自噬与增殖的影响凝血酶(F2)是促VSMC增殖剂,在VSMC中加入F2后LC3表达有所降低,PCNA的表达明显上调;F2与雷帕霉素共同作用时,LC3的表达明显上升,而PCNA则显著下调;但与单独使用雷帕霉素组相比LC3的表达量又有一定降低,F2与3-MA同时作用时,自噬被抑制,而PCNA明显上调,与单独使用3-MA的组相比LC3的表达量也有一定降低。三.自噬抑VSMC增殖的机制研究实验选用胃酶抑素抑制溶酶体途径,检测LC3、PCNA的表达变化,结果发现,胃酶抑素与雷帕霉素共同作用时,LC3表达上调,而PCNA的表达与雷帕霉素组相比明显上调,与3-MA组相比PCNA表达更显著。结论:1、雷帕霉素的抑VSMC作用与自噬激活有关,自噬作用能抑制VSMC增殖。2、促进细胞增殖因素(F2)有降低自噬水平的作用,但效果不显著。3、自噬抑VSMC的作用机理与溶酶体途径有关。