银杏种子中银杏酸的脱羧方法研究

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在我国,白果(银杏种子)资源丰富,但对其产品的开发却进展缓慢。白果中银杏酸的毒性限制了白果的开发和应用。本文以银杏酸C15:1标准品为基准,利用液相-质谱联用仪(LC-MS),建立了白果中银杏酸含量的定量分析方法。同时,提出了利用强碱吸收CO2强化银杏酸的热降解和新的银杏酸生物脱羧的降解方法。主要研究工作包括如下几个方面:建立了一种以异丙醇为提取溶剂,对白果中的银杏酸进行振荡提取的方法,通过单因素试验确定了转速为130 r·min-1振荡提取法的最佳提取温度为28℃、最佳时间为120 min、最佳液料比为25:1(mL/g)。结果表明,该方法可替代Soxhlet提取器提取应用于白果中银杏酸测定的前处理过程,简化了测定程序,缩短了样品处理时间。采用液相-质谱联用仪(LC-MS)对白果中的银杏酸进行了定量分析。使用SIM质量分析模式,流动相为异丙醇/乙腈/冰乙酸(42/57/1,v/v/v),验证结果显示了该方法的精密度(RSD=3.298%)、回收率(102.274%,RSD=4.518%)和灵敏度(LOD=3.689×10-4 mg·mL-1,LOQ=2.452×10-3 mg·mL-1)。采用NaOH吸收银杏酸加压热脱羧降解过程中产生的CO2,有效强化了银杏酸的降解效果,在135℃与10%的NaOH同时处理120min,使白果中银杏酸C15:1的含量从 169.040±0.030 mg·kg-1降低为 2.097±0.045 mg·kg-1。将白果置于37℃下自然发酵30 d得到白果发酵样品,从中筛得一株细菌对银杏酸有降解作用。结果表明,1 mL该菌的细胞破碎液在37℃、pH自然、5 h内使银杏酸 C15:1 的含量降低了(18.409±0.075)%。人工合成了Kirimura等报道的水杨酸脱羧酶基因(sdc),并构建了重组质粒pET21a(+)-sdc,并将其转入E.coli BL21(DE3)中,成功表达了水杨酸脱羧酶,结果表明,1 mL pET21a(+)-sdc/E.coli BL21(DE3)的细胞破碎液在 40℃、pH=5.5、5h 内使银杏酸 C15:1 的含量降低了(39.017±0.131)%。试验了两株丝孢酵母(Trichosporon moniliiforme 2.2390 和 Trichosporon moniliiforme 2.2665)对银杏酸的降解作用,其中编号为2.2390的丝孢酵母可以降解银杏酸,而编号为2.2665的丝孢酵母对银杏酸没有降解作用。结果表明,1 mL Trichosporon moniliiforme 2.2390 的细胞破碎液在 40℃、pH=5.5、16h内使银杏酸C15:1的含量降低了(55.465±0.077)%。
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