结肠炎耶尔森氏菌适配体定向筛选及抗菌材料合成研究

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常言道:民以食为天,食以安为先,食品卫生和食品安全关系到每一个人的身体健康和生活质量。而与人类共存几千年的致病菌一直不断地对人类的生命安全构成严重的威胁。小肠结肠炎耶尔森氏菌是一种较为常见的致病菌。该菌广泛存在于食品和环境中,能够引起人的急性胃肠炎型食物中毒。本论文利用全细胞指数富集的配体系统进化技术(SELEX),旨在筛选出针对小肠结肠炎耶尔森氏菌的亲和力高、特异性好的新型适配体序列,此外,还研究了所筛选的适配体结合机制以探讨其结合机理,发明了一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的夹心型检测方法,并制备复合纳米材料以探究其对目标菌的抑制效果。具体内容如下:首先,论文第一章对小肠结肠炎耶尔森氏菌的来源、分类和致病机理做了详细的背景介绍,并且对该菌现有的分离和检测技术做简要的概括。然后,对现有的适配体筛选方法进行比较、分析,针对全细胞-SELEX技术做详细介绍。并对适配体与靶标的结合机理和所筛选纳米材料对于不同病原体的抗菌性能做了详述。其次,通过全细胞-SELEX技术对不同生长阶段的小肠结肠炎杆菌进行适配体筛选。将第10轮SELEX富集产物克隆测序后,根据同源性和二级结构的相似性将序列分为7个家族。流式细胞仪分析显示,适配体M1、M5和M7的Kd值分别为37.93±7.88、74.96±21.34、73.02±18.76,对靶标的亲和力和特异性最高。流式细胞仪分析还表明,所筛选的适配体对于不同生长阶段的小肠结肠炎耶尔森氏菌细胞有显著的亲和力。激光共聚焦显微镜表征结果显示所筛选的M1适配体能够特异性地识别目标菌。再次,进一步研究了细菌细胞上适配体结合位点的识别,理解了适配体结合机制以及发明了对于目标菌的基于适配体夹心型检测方法。实验是通过对所筛选的适配体进行FAM标记、设计不同对照组实验、通过流式细胞仪和微孔板读数器测量荧光信号来进行的。结果显示M1适配体可能与目标菌的脂多糖特异性结合。此外,在夹心型检测方法中,应用双适配体M1和M7分别作为捕获和检测探针,显著识别了小肠结肠炎耶尔森氏菌,检测限达到70 cfu/m L。本研究表明,所选的适配体具有潜在的应用于小肠结肠炎耶尔森氏菌检测的能力。最后,在成功地将适配体应用于小肠结肠炎耶尔森氏菌检测之后,我们应用了壳聚糖-磁性纳米颗粒复合材料(Chitosan-MNPs)作为针对目标细菌的抗生物剂。进行了抑菌圈试验、抗菌试验、最低抑菌浓度和时间动态试验,结果表明,纳米粒子的浓度与抗菌活性成正比。抑菌圈的平均大小在10.518.5 mm之间。与壳聚糖和磁性纳米颗粒相比,Chitosan-MNPs在40μg/m L的浓度下杀死了99%的细菌,显示出高抗菌活性。此外,时间动态杀菌活性揭示了Chitosan-MNPs的抗菌毒性与细菌的浓度和接触时间成反比。Chitosan-MNPs的高抗菌作用归因于两种材料的协同作用。Chitosan-MNPs与细菌细胞相互作用,导致活性氧产生和纳米复合材料渗透到细胞中,导致细菌细胞结构的破坏,最终导致细胞死亡。我们的结果表明,Chitosan-MNPs可能是一种很好的抗菌剂,用来抵抗细菌耐药性的发展。综上,我们筛选出多种针对小肠结肠炎耶尔森氏菌的多功能适配体,研究适配体和目标菌结合机制,以及适配体可能的结合位点,开发了基于适配体的检测方法,以及开发了新型抗菌纳米材料以抑制耐药靶细菌的生长。
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