本文利用基因重组技术构建了能够高水平表达外源丙酮酸氧化酶的重组大肠杆菌,并对其高密度培养做了系统研究。具体内容有以下几方面： 利用PCR技术,从Aerococcus viridans ATCC 10400基因组中扩增出丙酮酸氧化酶基因(AvPyOD),并将该基因克隆入pSML104载体质粒中,得到重组质粒pSMLPyOD,然后将重组质粒pSMLPyOD转化E. coli DH5α细胞,得到能够组成型表达外源丙酮酸氧化酶的重组大肠杆菌DH5α/pSMLPyOD,通过快速筛选指示平板法直接筛选到高表达量的阳性重组大肠杆菌DH5α/pSMLPyOD。 对重组大肠杆菌DH5α/pSMLPyOD发酵培养基做了系统优化。逐步采用单因素实验、两水平部分析因实验(FFD)、中心组合设计(CCD)及响应面方法(RSM)对培养基各组分优化后,得到重组大肠杆菌DH5α/pSMLPyOD的最优发酵培养基：甘油,10 g/L;蛋白胨,15 g/L;酵母提取物,12 g/L;硫酸铵,4 g/L;复合磷酸盐,7 g/L;MgSO4,2g/L,微量元素母液,1.25 mL/L;NaCl,10 g/L。利用该培养基可以使重组菌产丙酮酸氧化酶单位达到870 U/L。 在已优化培养基基础上对摇瓶发酵过程中重组菌质粒稳定性进行研究,结果表明,以甘油为碳源,37℃,装液量10-15％条件下重组菌质粒稳定性最好。发酵过程pH对质粒稳定性影响不大,但pH控制在较低水平(6.5)更有利于质粒外源蛋白的表达。此外,外源蛋白表达使得重组菌质粒稳定性有所下降。 研究了温度对重组大肠杆菌DH5α/pSMLPyOD生长,外源丙酮酸氧化酶表达及代谢方面的影响。结果表明,37℃条件培养最有利于重组菌的生长,37℃培养,发酵结束时重组细胞仍保持很高生理活性。但低温32℃条件最有利于重组细胞表达外源丙酮酸氧化酶；外源丙酮酸氧化酶能够诱导重组菌胞内过氧化氢酶和过氧化物酶的表达,低温条件下胞内过氧化氢酶和过氧化物酶活性更高,说明低温条件下重组细胞抗H2O2的能力更强,采用后期降温的变温培养方式能够显著提高重组大肠杆菌DH5α/pSMLPyOD的丙酮酸氧化酶单位；外源丙酮酸氧化酶在重组细胞内主要以可溶性形式存在,包涵体形成量很少。 研究不同温度策略、补料液、补料方式等对重组大肠杆菌DH5α/pSMLPyOD高密度发酵的影响,建立了基于阶梯式降温的DO-stat反馈补料方式,实现了重组菌的高密度培养,34小时发酵终了时重组菌菌浓(OD600)能够达到110,PyOD产量达到3690U/L,该单位甚至高于目前市售ALT测定试剂盒中丙酮酸氧化酶的活性单位。 对分批补料发酵过程中底物消耗,菌体生长及产物生成等方面进行动力学研究,建立了重组菌分批补料发酵的动力学模型。验证实验表明,模型能够很好地拟合实验结果。 采用两种不同的方法对外源丙酮酸氧化酶进行分离纯化：其一为常规的硫酸铵分步沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换和UltrogelAcA34凝胶过滤三步纯化；另一方法为Ni-IDA亲和层析一步纯化。结果显示：前者纯化的酶比活力为1.1 U/mg,回收率为29.8％,纯化倍数为10,纯度达到87％以上,后者纯化的酶比活力为2.92U/mg,回收率为43.3％,纯化倍数为8.1,纯度达到93％以上。综合各方面,选择Ni-IDA亲和层析用于重组Aerococcus viridans ATCC10400丙酮酸氧化酶的分离纯化对重组Aerococcus viridans ATCC10400丙酮酸氧化酶酶学性质研究表明：重组酶的最适pH7.0,最适反应温度37℃,pH6.5时酶的稳定性最高,在37℃以下,酶的温度稳定性最高,Mg2+和Mn2+为重组酶的最佳辅因子。