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研究背景腹泻病是多种病原体、多种致病危险因素共同引起的以排便次数增加和大便性状变化为特点的一组疾病。是发展中或贫穷国家地区儿童营养不良的重要原因及死亡的主要原因之一。中国疾控2014-2015统计数据显示,感染性腹泻发病率在62.4/10万至74.8/10万,发病人群中超过一半是5岁以下儿童,在腹泻各年龄分组中≤1岁以下儿童的年发病率和发病人数最高。其中5岁以下儿童腹泻主要病因是各种病原体的感染,主要是病毒、其次是细菌、寄生虫和真菌相对少见。病毒中包括轮状病毒、杯状病毒(诺如病毒)、星病毒、腺病毒等。人星状病毒(Human Astrovirus,AstV)是引起婴幼儿、年长者和免疫功能不全患者病毒性腹泻的重要病原体之一,其感染获得的适应性免疫在各基因型之间不存在交叉保护作用。HAstV感染多为散发,但也可在托儿所、养老院、收容所、医院、学校等场所引起感染暴发导致疾病流行。星状病毒(astrovirus,AstV),是一种无包膜的、具有二十面体固体外壳的单股正链RNA病毒,因在电子显微镜下呈星形而得名,基因组全长6.4-7.3kb,包含3个开放读码阅读框架(open reading flame,ORF)。目前根据ORF2区编码衣壳蛋白序列的血清型将HAstV分为经典型HAstV,包括8种基因型(HAstV-1﹣HAstV-8),其中经典型HAstV-1流行最广泛,以及新型HAstV,包括人星状病毒墨尔本株(HAstV-MLB)和人星状病毒弗吉尼亚株(HAstV-VA)。我国多个地区的研究结果显示5岁以下急性腹泻患儿的HAstV检出率在2.5%-6.7%。HAstV具有明显的季节性,多集中在低温季节。其感染引起婴幼儿急性病毒性胃肠炎主要临床特点有轻度水样腹泻、发烧、食欲减退、恶心感、呕吐和腹痛等,较少导致脱水及住院。但有儿童发育迟缓、儿童消瘦、免疫功能不全、复合感染和存在其他肠道基础疾病的患儿病情较重。研究目的为了解HAstV在2018年1月-2019年12月中国广州地区门诊5岁以下星状病毒感染导致急性腹泻患儿中的分子流行病学特征。研究方法1、收集广州市妇女儿童医疗中心儿童院区、妇婴院区、增城院区三所医院门诊2018年1月至2019年12月5岁以下急性腹泻组儿童679例和非腹泻组儿童391例粪便样本及其相关的临床信息。2、从收集到粪便样本中提取病毒核酸,提取到的RNA采用引物M269/M270对核酸样本中HAstV的ORF2区进行RT-PCR扩增得到大小为449bp的片段,将扩增得到产物进行电泳验证。3、获得的阳性标本重新扩增和产物纯化,特异性产物的纯化,连接及转染,进行克隆菌培养,提取质粒并进行鉴定,得到核苷酸序列。4、阳性核苷酸序列外送测序,从Gen Bank数据库获取对照所采用的参考病毒毒株基因序列。用Geneios10.1.3软件计算序列相似性计并进行相关性分析,将测序结果及参考序列使用Mega10.0软件进行序列对比分析及采用邻接法(Neighbor-joining method)构建绘制系统进化树图谱。结果1、门诊急性腹泻组679例中HAstV检测阳性33例,检出率为4.9%。非腹泻组391例中HAstV检测阳性9例,检出率为2.3%,两者间有统计学差异(X2=4.306,P=0.038)。2、急性腹泻组中HAstV检测阳性男性19例,阳性率5.1%(19/372),女性14例,阳性率4.6%(14/307)。非腹泻组中男性阳性率1.5%(6/391),女性阳性率0.8%(3/391),均无显著统计学差异。3、急性腹泻组2岁以下星状病毒检出率为5.0%(24/481),与非腹泻组2岁以下检出率1.2%(2/165)存在统计差异(X2=4.538,P=0.033)。急性腹泻组2岁以上检出率4.5%(9/198)与非腹泻组3.1%(7/226)无显著统计学差异。急性腹泻组HAstV阳性月龄均值为19月,95%置信区间为(18,20)。非腹泻均值31月,95%置信区间(29,33),具有显著统计学差异(t=10.608,P<0.0001)。急性腹泻组中0-12月龄、12-24月龄、24-36月龄、36-48月龄、48-60月龄不同月龄/年组的HAstV检出率分别为3.5%、6.6%、5.8%、3.6%、3.4%、4.9%,经X2检验,不同月龄组检出率无显著统计学差异。4、急性腹泻组中1年间季节检出率无明显差异,其中春季检出率最高(6.0%,17/281),夏秋季最低,均为(3.2%,5/154),月份间检出率无显著统计学差异,1月最高(6.7%,9/134),9月最低(1.7%,1/58)。5、急性腹泻组HAstV检测阳性与检测阴性患儿在发热、呕吐、脱水、腹痛、抽搐、心肌损害、酸中毒、贫血等临床症状方面表现、粪便形态方面如粪便中红细胞数目、粪便中白细胞数目、水样便、血样便、粘液样便、其他类型的粪便、合并症如乳糖不耐受、呼吸道感染,其他疾病如系统性红斑狼疮、过敏性紫癜、牛奶蛋白过敏等合并腹泻等经X2检验无显著统计学差异。6、系统进化分析结果显示:急性腹泻组患儿33例检测阳性中26株(检出率3.8%,26/679)HAstV-1型、5株HAstV-4型(检出率0.7%,5/679)及2株HAstV-5型(检出率0.3%,2/679)星状病毒。非腹泻患儿中6株(检出率1.5%,6/391)HAstV-1型、1株HAstV-4型(检出率0.3%,1/391)及2株HAstV-5型星状病毒(检出率0.5%,2/391)。其中急性腹泻与非腹泻儿童HAstV-1型检出率有统计学差异(X2=4.503,P=0.0338),7、急性腹泻组中HAstV检测阳性中最小年龄为3月龄,均值为20月龄,0-12月龄占比27.3%(9/33),12-24月龄占比45.5%(15/33)。检测阳性比例较高在春季的1月份27.3%(9/33)、2月份18.2%(6/33)和冬季的12月份21.2%(7/33)。8、序列同源性分析结果显示HAstV-1型检测阳性共6株为中国河北2015年分离株(Genbank登录号KY311972.1)(2株来自非腹泻组)和26株来自匈牙利2010年分离株(Genbank登录号HQ398856.2)(4株来自非腹泻组),HAstV-4型与英国牛津分离毒株(Genbank登录号L38506)、德国德累斯顿分离毒株(Genbank登录号AY720891)同源性相近。HAstV-5型与匈牙利布达佩斯2012年分离株(Genbank登录号KF157967)同源性相近。结论1、星状病毒是广州地区5岁以下儿童急性腹泻的重要病原体之一,HAstV-1型是流行优势株,主要感染2岁以下儿童。2、星状病毒感染导致发病无性别差异,在广州地区主要发生在寒冷季节(10月份至次年2月份)及雨季(7月份)。3、星状病毒引起儿童急性腹泻表现为轻型急性胃肠炎,临床症状一般较轻,且较少出现合并症。4、广州检测出HAstV-1型主要是中国河北2015年分离株(Genbank登录号KY311972.1)和匈牙利2010年分离株(Genbank登录号HQ398856.2)。