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研究背景与目的：肺炎链球菌是一种较为常见的革兰氏阳性致病菌，约40﹪～50﹪健康人群携带有肺炎链球菌。当机体抵抗力下降时，如麻疹等呼吸道病毒感染以后，营养不良或者老年体弱等情况下，肺炎链球菌将透过粘膜防御体系，从粘附部位下行至肺或者进入血液引起细菌性肺炎，以及中耳炎、菌血症、脑膜炎等相关疾病。在英国，40﹪～50﹪的社区获得性肺炎(community acquire pneumonia，CAP)以及20﹪的脑膜炎由它引起的。在美国，致命性的肺炎链球菌感染病例每年约有40000例。由肺炎链球菌所引起的社区获得性肺炎有着较高的死亡率，在不同的发达国家这一比例平均达到20﹪～50﹪左右，30﹪～60﹪幸存者都有不同程度的长期后遗症，包括听力丧失，神经缺陷，以及神经心理损伤。在我国，肺炎链球菌感染致病人群主要为儿童。一项对北京地区307名儿童咽试子细菌培养调查显示，健康儿童中肺炎链球菌的平均带菌率为18.6﹪，居各细菌之首。对各年龄组分别统计显示，1～3岁组儿章带菌率最高，为29.5﹪；4～6岁组为18．7﹪；7～9岁组为8.62﹪；10～13.56﹪。随着目前耐万古霉素肺炎链球菌菌株的发现，更意味着抵抗该菌感染最后一道防线的丧失。而目前市场上广为使用的荚膜多糖疫苗以及结合疫苗由于其固有的局限性，使得预防肺炎链球菌感染，特别是对高危人群(60岁以上的老人和5岁以下的幼儿)感染的预防变得更为困难。发展新一代蛋白质疫苗以及抗原表位亚单位疫苗已经成为必然而迫切的实际需要。
研究结果
一、按照《生物制品规程》、《新生物制品审批办法》以及中国发明专利申报相关要求，完成了肺炎链球菌LytA重组蛋白疫苗的制备及鉴定工作。
(1)扩增了两端带有完整酶切位点的LytA编码基因片段，测序表明与构建的序列与理论序列完全一致。
(2)完成了宿主菌和工程菌大体菌落形态、低倍镜下观、高倍镜下观、电镜下观察、药敏反应、生化反应等鉴定为生物制品申报以及专利申请提供了必须的基本实验室研究资料。电镜观察表明，本实验室构建的工程菌不具有菌毛和鞭毛，为非致病性大肠杆菌。
(3)在诱导过程中，本实验室所构建的LytA重组质粒具有良好的稳定性，均在96﹪以上。
(4)将传代后的第50、40、30、20、10代工程菌与原始种子工程菌进行生物化学与药物敏感测定。结果经对比分析后表明，多次无抗生素选择压力条件下培养传代后其生物化学反应以及耐药谱均没有发生改变。
(5)本实验室构建的用于表达LytA的工程茵在pH为7.0的LB培养基、37℃、转速为250rpm的条件下摇瓶培养1.5小时后即达到快速生长中期。
(6)在LB、SOB、TB、XY等不同培养基中摇瓶培养表达自溶酶融合蛋白，结果发现经LB培养后目的蛋白在全菌蛋白中的表达量所占比例最大。
(7)诱导表达过程中，加入IPTG诱导后，LytA在25℃或者37℃的条件下有较高比例的表达，在25℃时表达比例较高一些，并且包涵体形成很少，主要以可溶性表达为主。
(8)在诱导表达中，当LB培养液的pH值处于6.8～7.0左右时，目的蛋白有较高比例的表达。
(9)接种量在1﹪、5﹪、10﹪时其表达比例均较高，三者之间差别不大，考虑到纯化表达过程中成本优化问题，确定1﹪的接种量为最佳接种量。
(10)随着装液量的增加，蛋白表达的绝对量也呈增加趋势，但是在40﹪的装液量时其蛋白的表达比例最高。
(11)在25℃低温诱导条件下，诱导2h、4h、6h、8h、10h后蛋白均有较为大量的表达，并且表达百分比趋于一致。为简化表达纯化工艺流程，降低成本，选择2h～4h为纯化表达工艺中最佳诱导时间。
(12)综合LytA表达纯化过程中各种优化条件的分析，确定了LytA表达的稳定与最优化体系，采用凝胶色谱、大孔径碳柱分析，分析方法用HPLC面积归一化法，测得蛋白疫苗混合组分中LytA主含量所占比例为95.7﹪。
(13)等电聚胶分析，测定LytA的实际PI为5.0。
(14)LytA氨基酸组成分析：对照理论百分比组成(来自于NCBI查询结果)，发现实际含量最高者为Asp，最低者为Cys。除Asp、Thr、Glu、Gl y、Val、Leu、Arg外，其他基本相符，而差异最大的是Asp、Val这两种氨基酸。
二、LytA重组蛋白疫苗可以诱导产生呼吸道粘膜sIgA的产生，动物实验证明其安全性符合《新生物制品审批办法》中相关要求。
(1)LytA进行初步的毒性安全实验分析发现免疫后观察七天，动物健存，体重增加，注射处无红种，无结痂。
(2)与多糖疫苗免疫过的小鼠以及正常对照小鼠相比，运用重组的LytA蛋白免疫后的小鼠，其血清中IgG、IgA抗体水平均特异性升高，sIgA在肺、鼻咽灌沈液中有较高水平，而在肺灌洗液中更高一些。
(3)经肺组织大体观察、病理组织切片观察发现自溶酶蛋白免疫能为5种不同血清型(6B、6A、19F、23F、14)的肺炎链球菌感染的小鼠提供较好的免疫保护力。自溶酶蛋白免疫对19F血清型肺炎链球菌攻击感染后小鼠的保护性很好，小鼠存活率达到80﹪。对23F、6B血清型肺炎链球菌攻击感染后小鼠的保护性较好，小鼠存活率达到60﹪。而对照组存活率仅为30﹪。FITC荧光标记抗体定位分析结果表明，LytA免疫后，在小鼠气管粘膜表面、肺泡表面有、sIgA分布。为自溶酶蛋白免疫能诱导先天性免疫保护效应提供了一定的实验依据。
三、成功预测并克隆构建了含有多表位抗原基因的重组质粒，实现了多表位抗原的成功表达，纯化的抗原蛋白分子量为5kDa。
(1)综合多种生物信息学预测工具的分析选定序列2～28(EINVSKLRTDLPQVGVQPYRQVHAHST)为可能的B细胞抗原表位，序列98～112(FMTDYRLYIELLRNL)为可能的T细胞抗原表位。并且预测的MHC-Ⅱ类分子结合肽序列与预测的B细胞抗原表位序列是重叠的。
(2)不同血清型肺炎链球菌LytA的抗原表位分布并不存在差异。
(3)重组表达载体的筛选和鉴定结果表明目的基因序列没有发生移码突变，重组表位的实际基因序列与理论设计完全一致。
(4)重组质粒pGEX-4T-1-1<,1>1<,2>诱导后SDS-PAGE电泳显示，在沉淀样品中出现一大小约为31kDa较粗的蛋白条带，这是GST和插入其下游的5kDa的重组抗原表位L<,1>L<,2>所形成的融合蛋白。经IPTG诱导的空载pGEX-4T-1大肠杆菌在26 kDa处出现一明显条带，为空载体诱导后所表达的GS7。蛋白。
小结按照《生物制品规程》、《新生物制品审批办法》和中国发明专利申请要求，我们对本实验室pGEX-4T-1质粒、所构建的LytA表达重组质粒稳定性进行了鉴定。对宿主菌和工程菌的稳定性、耐药性、生化反应特性等进行了鉴定分析，并对LytA的相关理化性质进行了鉴定。对LytA的保护性进行了进一步的验证。结果显示所构建的重组质粒、工程菌菌具有较高的稳定性，适合运用于规模化的工业生产，建立的LytA重组表达体系具有稳定性、高效性的特点。本研究基本完成了肺炎链球菌LytA重组蛋白疫苗的临床前期研究工作，有关内容已经申报发明专利(申请号：200710027897.7)。动物实验表明，LytA免疫后可呼吸道粘膜以及肺泡粘膜表面产生特异性的sIgA，对不同血清型肺炎链球菌具有较好的免疫保护作用。应用生物信息的方法对LytA的可能抗原表位进行了分析，确定了可能的B、T细胞抗原表位，并构建了带有linker序列的重组抗原表位，并实现了多表位抗原的重组表达。为后期的抗原表位亚单位疫苗研制奠定了良好的基础。