目的:1.探讨NLRP3炎症小体（NACHT,LRR,and PYD domains-containing protein 3,cryoporin）依赖性细胞焦亡在肝纤维化进程中的作用,并明确肝内发生NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡的主要细胞类型;2.解析在肝纤维化进程中细胞焦亡与DAMP分子S100A8/S100A9的关系;3.研究DAMP分子S100A8诱发NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡的作用、分子机制及其对肝纤维化进程的影响;4.探讨DAMP分子S100A8及焦亡产物GSDMD（gasdermin D）、白介素1β（interleukin 1β,IL-1β）和白介素18（interleukin 18,IL-18）在肝纤维化诊断、分级中的潜在价值。通过本研究,为揭示肝纤维化的发病机制积累实验依据,同时也为发现其新的诊断标志物和干预靶点提供线索。方法:1.NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡在肝纤维化进程中的作用1.1肝纤维化进程中是否存在细胞焦亡1)肝纤维化患者肝组织中焦亡产物GSDMD、IL-1β和IL-18表达水平的检测:采用免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）;2)肝纤维化患者血清中GSDMD、IL-1β和IL-18的水平检测:采用酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）;3)在肝纤维化模型小鼠体内验证焦亡的存在:6～8周龄雄性C57BL/6小鼠腹腔注射CCl4（模型组）或橄榄油（对照组）,每周2次,连续8周,每组5只。最后一次注射后72 h处死小鼠并取其肝组织和血清进行后续实验。（1）肝损伤和纤维化程度的检测:采用HE染色分析组织病理形态、天狼星红染色检测胶原沉积和IHC检测肝星状细胞活化标志α-SMA;（2）焦亡标志物的检测:IHC检测模型小鼠肝组织中GSDMD和IL-1β表达水平,ELISA检测模型小鼠血清GSDMD、IL-1β和IL-18的水平。1.2明确肝纤维化组织中发生NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡的主要细胞类型:双重免疫荧光检测患者和模型小鼠肝纤维化组织中的NLRP3、肝细胞标志物albumin、巨噬细胞标志物F4/80和肝星状细胞标志物α-SMA,再分析NLRP3分别与后三者是否存在共定位,以此鉴别发生此类焦亡的细胞类型。1.3 NLRP3炎症小体依赖性肝细胞和巨噬细胞焦亡在肝星状细胞活化中起的作用。1)建立焦亡的细胞模型和制备焦亡细胞的条件培养基（conditioned media,CM）:采用1μg/ml脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）:刺激人正常肝细胞L-02细胞和人单核巨噬细胞THP-1分化而来的巨噬细胞,诱导其产生焦亡。24 h后用q RT-PCR检测细胞中焦亡产物IL-1β的m RNA水平,48 h后用ELISA检测培养上清液中IL-1β的蛋白质水平,以确认焦亡诱导成功。同时收集上清液,制备成焦亡细胞的CM,即Pyroptosis-CM（简称Pyro-CM）;2)细胞焦亡对肝星状细胞活化的影响:用Pyro-CM处理人肝星状细胞LX-2,48 h后用Western blot检测肝星状细胞活化和胶原沉积的标志物I型胶原蛋白（collagenⅠ,COLIA1）、平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）的蛋白质水平。1.4体内外验证NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡在肝纤维化中的作用。1)按1.1中方法构建肝纤维化小鼠模型,加设试剂对照组（CCl4+0.9%Na Cl）和用药组（CCl4+MCC950）,后两组在腹腔注射CCl4的基础上分别腹腔注射0.9%Na Cl溶液或MCC950,8 w后处死小鼠并取其肝组织和血清进行如下检测,以判断该抑制剂对NLRP3炎症小体依赖性焦亡及肝纤维化进程的影响;2)该抑制剂对NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡的影响:通过IHC检测和比较两组肝组织中NLRP3、GSDMD和IL-1β表达水平的差异来判断;3)该抑制剂对肝损伤和纤维化程度的影响:按1.1中方法分析之,包括HE染色、天狼星红染色和IHC法检测α-SMA;同时加做肝功能检测,包括血清中ALT、AST和TP水平;4)体外抑制NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡后,观测肝星状细胞活化水平的变化:用1μM NLRP3的特异性小分子抑制剂MCC950预处理L-02细胞1 h后,再用1μg/ml LPS刺激48 h,收集上清液并制备成CM（MCC950-Pyro-CM）;用后者处理LX-2细胞24 h,q RT-PCR检测COLIA1、α-SMA和TGF-β的m RNA水平。2.在肝纤维化进程中细胞焦亡与DAMP分子S100A8/S100A9的关系2.1 S100A8/S100A9水平与肝纤维化程度的相关性研究F0-F4级肝纤维化患者和0 w、4 w、6 w和8 w肝纤维化小鼠模型的肝组织和血清中S100A8和S100A9水平:分别采用IHC和ELISA检测。2.2焦亡标志物水平与肝纤维化程度的相关性研究1)动态曲线分析F0-F4级肝纤维化患者血清中GSDMD、IL-1β和IL-18水平随分级而变化的趋势;2)不同时段的肝纤维化模型小鼠的焦亡标志物检测及其动态曲线分析:（1）按1.1中方法建模,分别在4 W、6 W和8 W处死小鼠,取其肝脏和血清;（2）IHC检测NLRP3表达水平变化;按1.1中方法检测肝损伤、肝纤维化及焦亡标志物;（3）动态曲线分析不同时段的肝纤维化小鼠模型血清中GSDMD、IL-1β和IL-18水平变化趋势。2.3对F0-F4肝纤维化患者血清S100A8水平与焦亡相关标志物GSDMD、IL-1β和IL-18血清水平进行相关性分析。3.DAMP分子S100A8诱发NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡的作用、分子机制及其对肝纤维化进程的影响3.1探究S100A8对NLRP3炎症小体依赖性肝细胞和巨噬细胞焦亡的诱导作用。用不同浓度的人重组S100A8（recombinant human S100A8,rh S100A8）（2、5或10μg/ml）处理L-02细胞和THP-1巨噬细胞后,检测其焦亡相关指标的变化,包括:1)24 h后用q RT-PCR检测NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的m RNA水平;2)48 h后用Western blot检测NLRP3,GSDMD,GSDMD P30,pro-IL-1β,IL-1β和cleaved caspase-1的蛋白水平;3)24 h后用流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测cleaved caspase-1/PI双阳性细胞;3.2 S100A8诱导NLRP3炎症小体依赖性肝细胞和巨噬细胞焦亡的分子机制1)探讨NF-κB信号通路是否涉及其中:（1）5 ug/ml rh S100A8分别刺激L-02细胞和THP-1巨噬细胞0,30,60,120 min后,Western blot检测两种细胞中NF-κB信号通路p-p65和p-IKKα蛋白水平变化;（2）抑制NF-κB信号通路对S100A8诱导的NLRP3炎症小体依赖性焦亡的影响:NF-κB抑制剂BAY 11-7082预处理细胞1 h后,再加入5 ug/ml rh S100A8处理,24 h后用q RT-PCR、48 h后用Western blot检测焦亡相关指标的变化;2)确认介导S100A8诱发NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡的胞外模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）:通过分别抑制TLR4信号通路和RAGE信号通路,观测它们对S100A8诱导的NF-κB活化以及S100A8诱发的NLRP3炎症小体依赖性焦亡的影响。TLR4抑制剂TAK-242或RAGE抑制剂FPS-ZM1预处理L-02细胞和THP-1巨噬细胞1 h后,再加入rh S100A8处理,60 min后Western blot检测p-p65和p-IKKα蛋白水平变化,24 h后q RT-PCR检测焦亡相关指标的变化;3)探讨活性氧（reactive oxygen,ROS）是否参与S100A8诱发的NLRP3炎症小体依赖性焦亡:（1）ROS水平的检测:S100A8刺激L-02细胞和THP-1巨噬细胞6 h后,用FCM检测DCFH-DA探针荧光强度,分析两种细胞中ROS水平;（2）ROS抑制剂对S100A8诱发NLRP3炎症小体依赖性焦亡的影响:ROS抑制剂DPI预处理L-02细胞和THP-1巨噬细胞1 h后,再加入rh S100A8处理48 h,Western blot检测焦亡相关标志物的变化;3.3 S100A8诱发的NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡在肝纤维化中的作用1)用不同浓度的rh S100A8（2、5、10μg/ml）处理L-02细胞和THP-1巨噬细胞,48 h后收集其CM培养LX-2细胞。24 h后用q RT-PCR、48 h后用Western blot检测LX-2细胞中纤维化标志物COLIA1、α-SMA和TGF-β的表达;2)用1μM MCC950预处理L-02细胞和THP-1巨噬细胞1 h后,再用5μg/ml rh S100A8刺激48 h,收集其CM;用后者培养LX-2细胞,48 h后用Western blot检测LX-2细胞中纤维化标志物的表达。4.DAMP S100A8及焦亡相关标志物的在肝纤维化临床诊断中的意义:绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线,通过计算ROC曲线下面积（area under the ROC curve,AUC）,评价血清S100A8、GSDMD、IL-1?和IL-18水平对肝纤维化发生及其严重程度的预测能力,并根据标准公式计算敏感性和特异性。结果:1.NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡在肝纤维化进程中的作用1.1肝纤维化进程中有细胞焦亡发生1)肝纤维化患者肝组织中GSDMD、IL-1β和IL-18表达水平明显高于健康对照组（healthy controls,HCs）;2)与HCs相比,肝纤维化患者血清GSDMD、IL-1β和IL-18水平显著升高（p＜0.001或0.01）;3)CCl4组小鼠肝损伤和纤维化程度高于对照组,提示我们构建纤维化模型成功;CCl4组小鼠肝组织中GSDMD和IL-1β水平明显高于对照组;同样,CCl4组小鼠GSDMD、IL-1β和IL-18血清水平也显著高于对照组（p均＜0.01）。以上实验结果提示肝纤维化进程中有细胞焦亡的发生。1.2共定位分析揭示在肝纤维化进程中NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡主要发生于肝细胞和巨噬细胞。1.3肝细胞和巨噬细胞的焦亡促进肝星状细胞的活化1)LPS处理的L-02细胞和THP-1巨噬细胞中IL-1β的m RNA水平和上清液中IL-1β的蛋白质水平明显高于对照组（p均＜0.01）;2)Pyro-CM孵育的LX-2细胞中细胞活化和胶原沉积的标志物COL1A1、α-SMA和TGF-β的蛋白质水平显著高于对照组。1.4抑制NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡的产生可减轻肝纤维化1)与NaCl对照组相比,MCC950抑制组小鼠肝组织中NLRP3、GSDMD和IL-1β的水平明显降低,提示MCC950可抑制NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡的发生;2)MCC950处理后肝损伤和纤维化程度明显低于对照组,并且其ALT和AST血清水平也明显低于对照组,而TP血清水平则明显高于对照组,提示抑制NLRP3及其介导的焦亡后,肝损伤和纤维化程度减轻;3)体外抑制NLRP3炎症小体依赖性肝细胞和巨噬细胞焦亡可抑制肝星状细胞的活化:MCC950-Pyro-CM处理组的LX-2细胞中细胞活化与胶原沉积标志物COL1A1、α-SMA和TGF-β的m RNA水平均显著低于Pyro-CM组（p＜0.01或0.001）。2.肝纤维化中细胞焦亡的发生与DAMP分子S100A8和S100A9水平增加有关2.1在肝纤维化患者和肝纤维化模型小鼠的肝组织和血清中S100A8和S100A9表达水平明显高于对照组,且随着肝纤维化程度增加而升高;其中,又以S100A8的升高更为明显。2.2焦亡标志物水平和NLRP3的表达水平与肝纤维化程度显著正相关1)F0-F4级肝纤维化患者血清GSDMD、IL-1β和IL-18水平随肝纤维化分级增高而升高;2)4 w/6 w/8 w肝纤维化模型小鼠:它们的肝损伤及肝纤维化程度、血清GSDMD、IL-1β和IL-18水平均随模型制备时间的延长而增强或升高;肝脏中NLRP3的表达水平也随模型制备时间的延长而升高。2.3血清S100A8水平与焦亡相关标志物GSDMD、IL-1β和IL-18血清水平均显著正相关（p＜0.001）。3.DAMP分子S100A8诱发NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡的作用、分子机制及其在肝纤维化进程中的作用3.1 S100A8可诱导NLRP3炎症小体依赖性肝细胞和巨噬细胞焦亡。1)不同浓度的rh S100A8（2、5、10μg/ml）可上调NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的m RNA水平（p＜0.05或0.01或0.001）;2)rh S100A8显著增加NLRP3炎症小体活化的下游蛋白的表达,包括剪切后的GSDMD（GSDMD P30）、剪切后的caspase-1和生物活性IL-1β;（3）rh S100A8处理显著增加caspase-1和PI双阳性的细胞（p＜0.001）。3.2 TLR4/NF-κB信号级联和ROS的产生参与介导S100A8诱发的NLRP3炎症小体依赖性肝细胞和巨噬细胞焦亡1)S100A8通过激活NF-κB信号通路实现其诱发NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡的作用:（1）与GST对照组相比,rh S100A8处理后60 min内,L-02细胞和THP-1巨噬细胞中p-p65和p-IKKα蛋白水平均有所提高;（2）NF-κB抑制剂BAY 11-7082对S100A8诱发的NLRP3炎症小体依赖性焦亡具有明显的抑制作用;2)TLR4参与介导S100A8诱发NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡:（1）S100A8上调细胞中p-p65和p-IKKα的作用被TAK-242显著抑制,而FPS-ZM1作用不明显;（2）TAK-242明显降低S100A8上调的L-02细胞和THP-1巨噬细胞中的NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18 m RNA水平,而FPS-ZM1影响较小;以上结果提示TLR4/NF-κB信号级联参与S100A8诱导的NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡的启动步骤。3)S100A8诱导产生的ROS是NLRP3炎症小体活化的次级信号之一:（1）S100A8显著增加L-02细胞和THP-1巨噬细胞中总的ROS水平（p＜0.001）;（2）ROS抑制剂DPI明显降低S100A8介导的焦亡相关指标NLRP3、GSDMD、pro-IL-1β、IL-1β以及GSDMD P30的蛋白水平。3.3 S100A8通过诱导NLRP3炎症小体依赖性肝细胞和巨噬细胞焦亡促进肝星状细胞活化:rh S100A8-CM孵育的LX-2细胞中纤维化标志COL1A1、α-SMA和TGF-β的m RNA和蛋白质水平均显著高于对照组;然而,MCC950则可抑制这种效应。4.GSDMD对肝纤维化发生及其严重程度的诊断价值最高,S100A8和IL-1β次之,IL-18最低。结论:1.细胞焦亡参与肝纤维化进程。2.肝细胞和巨噬细胞发生的NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡可促进肝纤维化进程;NLRP3是可有效减轻肝纤维化的潜在干预靶点。3.肝纤维化中细胞焦亡的发生与DAMP分子S100A8和S100A9水平增加有关。4.S100A8通过诱导NLRP3炎症小体依赖性肝细胞和巨噬细胞焦亡促进肝纤维化进程,其机制可能涉及TLR4/NF-κB信号通路的激活和ROS的产生。5.GSDMD是潜在的肝纤维化生物标志物。