帕金森病是一种多发于老年人的神经系统退行性疾病,目前该病已成为老年致残和病死的主要疾病之一,它的主要病理变化是投射至纹状体的黑质致密部多巴胺神经元和轴突进行性丢失。黑质内多巴胺神经元减少,使纹状体内多巴胺递质含量降低,引起中枢多巴胺和乙酰胆碱比例失调,在临床上出现震颤、肌肉僵直、运动弛缓等一系列神经精神症状。随着研究的深入,发现很多因素都参与了帕金森病的发病过程,目前尚无对该病发病机制的确切解释。然而,病理学上中脑黑质多巴胺能神经元的进行性丢失是确信无疑的。由于PD病因及病机的复杂性,至今尚无理想的治疗方法。近年来对神经干细胞的研究不断深入,许多学者试图通过刺激内源性神经干细胞的增殖分化为多巴胺能神经元,以补充丢失的细胞并恢复生理功能,中药在这方面也取得了一定的成果。本实验拟从中药诱导刺激内源性神经干细胞的增殖、分化的角度,揭示银杏叶提取物对MPTP诱导PD小鼠模型脑内神经干细胞增殖分化的干预效应和作用机制,为提高神经干细胞增殖分化为多巴胺神经元的能力提供新的手段和途径,也为中药防治PD提供科学基础和实验依据。本实验分为三个部分:(1)观察MPTP诱导的PD小鼠行为学、组织病理学变化以及银杏叶提取物的作用。(2)应用免疫组化和免疫双标相结合的技术观察PD小鼠脑内神经干细胞的增殖、分化及银杏叶提取物对其的影响。(3)应用免疫组化技术观察与多巴胺神经元发育密切相关的基因Nurr1在PD小鼠脑内的表达以及银杏叶提取物的影响。实验选用C57BL/6小鼠,动物随机分成3组:正常组、模型组和治疗组。正常组不作任何处理;模型组和治疗组首先采用生理盐水配制0.3%MPTP,腹腔注射(30mg/kg/d),连续5d,建立帕金森病小鼠模型。其中模型组造模之后不作任何处理,治疗组从造模第一天开始腹腔注射银杏提取物70mg/kg/d。各组动物的存活期分别是开始造模后的一周和四周。主要实验结果如下:(1)银杏叶提取物对帕金森病模型小鼠行为学和多巴胺神经元丢失的影响正常组小鼠动作灵敏、活动范围广,无震颤,爬杆顺利一般无停留,用时较短。在注射MPTP后,小鼠出现明显的PD行为学改变,包括急性改变(肢体震颤、竖尾、竖毛及跳、窜等)和慢性改变(动作迟缓,对外界反应下降等),这些表现尤其在第一周造模期间变化明显,检测爬杆用时也在第一周明显延长,与正常组差别显著,而在随后慢慢恢复,模型组和治疗组之间无差异,各组也趋于一致。在组织病理学上,可以看到正常组小鼠黑质神经元形态正常,体积正常,结构清晰,模型组一周、四周小鼠黑质神经元数量明显减少,有的胞体变小,胞核固缩。治疗组一周黑质神经元的数量比模型组有少量增多,形态和结构差异不是很明显;而治疗组四周小鼠黑质神经元数量明显增多,体积较正常,结构较清晰。TH免疫组化染色显示,正常组小鼠黑质致密部和腹侧被盖区见大量TH阳性神经元和纤维,密集成群,胞浆内棕色颗粒浓密。模型组和治疗组一周小鼠上述部位TH阳性细胞明显减少,纤维和胞体稀疏,以黑质致密部减少最为明显,阳性细胞数和IOD值与正常组相比有显著的差异,治疗组比模型组有所增多,差异显著。四周小鼠TH阳性神经元也显著减少,胞体少,纤维稀疏。阳性细胞数和IOD值比正常组仍减少明显,差异显著,治疗组与模型组相比,阳性细胞减少与模型组无差异,但IOD值明显较模型组增高。(2)银杏叶提取物对帕金森病模型小鼠脑内成体神经干细胞增殖的影响正常组HE染色,观察到在侧脑室外侧角和下角有少量深染的细胞。细胞较小,呈椭圆形或圆形,胞核深染,胞浆少,聚集存在,在外侧壁,细胞呈单层排列。模型组一周小鼠在侧脑室下角、外侧角和外侧壁,细胞数目比正常组明显增多,在外侧壁某些部位细胞呈多层分布,主要位于室管膜下区;治疗组细胞的数目比模型组增多。模型组和治疗组四周小鼠,与正常组相比也可见较多的细胞聚集在侧脑室下角、外侧角部位,但模型组和治疗组相比无明显差异。正常组小鼠可见少量PCNA阳性细胞在侧脑室外侧角、外侧壁和下角的室管膜下层表达。模型组一周,阳性细胞在上述部位明显增多,治疗组小鼠比模型组增多明显,还可以观察到从外侧角向外侧沿胼胝体下方排列的PCNA阳性细胞。造模后四周可以观察到,模型组和治疗组小鼠侧脑室壁阳性细胞均有不同程度的增多,但在统计学上无显著性差异。正常组小鼠可见少量PCNA阳性细胞主要表达在海马齿状回颗粒细胞下层中。造模后一周,三组小鼠之间海马齿状回PCNA阳性细胞数目无明显差异,但模型组和治疗组PCNA阳性细胞染色较深。四周,模型组小鼠表达显著增多,较正常组和一周模型组都有显著差异,而治疗组小鼠阳性细胞也有明显增多,比正常组增多有显著差异,但比模型组少。Nestin免疫组化观察到,正常组侧脑室外角和下角有少量阳性细胞表达,染色较浅,细胞较少。模型组一周小鼠在上述部位Nestin阳性细胞数明显增多,治疗组增加幅度更大。模型组和治疗组四周小鼠侧脑室Nestin阳性细胞数较第一周有所减少,但比正常组有显著增加。海马齿状回正常组Nestin主要表达在多形层细胞中,细胞数量较少。模型组一周小鼠Nestin阳性细胞明显增加,治疗组阳性细胞增加的更多,与正常组和模型组相比都有显著的差异。四周,模型组Nestin阳性细胞数基本同第一周,而治疗组Nestin阳性细胞数较正常组增多明显,但比治疗组一周少。PCNA/Nestin免疫双标观察到, PCNA + /Nestin +双标的细胞胞核呈深蓝色,覆盖棕色颗粒后甚至接近棕黑色,胞浆染色呈棕色集中出现在侧脑室下角和外侧角,外侧壁表达较少,海马齿状回颗粒细胞下层也有少量表达。细胞少且胞核染色淡。一周和四周,模型组和治疗组可以看到PCNA+/Nestin+细胞较正常组为多,但四周和一周相比没有显示出较大的差异。(3)银杏叶提取物对帕金森病模型小鼠脑内Nurr1表达的影响Nurr1免疫组化染色显示,正常组小鼠在黑质致密部可见数个散在分布的Nurr1免疫阳性细胞;在海马齿状回部位,Nurr1免疫阳性细胞较为集中在多形层,数量不多。一周,模型组黑质部位和海马齿状回部位Nurr1免疫阳性细胞较正常组明显增多,治疗组小鼠黑质和海马齿状回部位Nurr1免疫阳性细胞数量和光密度增加更为明显。四周,模型组小鼠黑质致密部阳性细胞数和光密度都与正常组比较无统计学差异;治疗组小鼠其阳性细胞光密度较正常组和模型组都有显著增加,差异显著。结论:(1)MPTP可导致黑质多巴胺能神经元丢失,其行为学变化在早期较明显。MPTP能够成功诱导PD小鼠模型,而银杏叶提取物可以在一定程度上保护PD小鼠黑质神经元的损伤和死亡,减缓PD病情的进展。(2)MPTP建立的PD小鼠模型本身能够刺激脑内室管膜下层和海马齿状回细胞的增殖,而银杏叶提取物在此基础上能够进一步刺激神经干细胞的增殖,并可能诱导其向远距离迁移。银杏叶提取物还能够增加与多巴胺神经元分化非常相关的Nurr1因子的表达,提示这些增多的神经干细胞有向多巴胺能神经元分化的可能。