胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。尽管近年来在手术、放化疗等领域取得了一定进展,但患者总体5年生存率仍<10%^[1]。沿着白质神经纤维、血管周围间隙和室管膜分布的早期侵袭性生长,是胶质瘤最突出的临床病理学特征,也是患者治疗失败的主要原因^[2,3]。因此,探索胶质瘤细胞是随机到达这些解剖结构,还是上述解剖结构能够使胶质瘤细胞获得生长优势?具有非常重要的意义。近来研究者发现Nestin⁺CD133⁺胶质瘤干细胞（Glioma stem cells,GSCs）在血管周围的聚集。血管中丰富的营养物质以及血管内皮细胞分泌的某些可溶性因子释放至血管周围区域的GSCs附近,维持GSCs干性并促进其侵袭。反过来,GSCs还可以分泌内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）来诱导内皮细胞迁移以及血管生成^[4,5]。GSCs与血管的这种空间关系可能是胶质瘤早期沿血管周围间隙侵袭性生长的主要原因^[4,5]。然而,GSCs和白质神经纤维之间的空间关系仍需进一步探索。本研究发现,CD133⁺的GSCs分布于白质神经纤维附近,发生脱髓鞘改变的白质神经纤维通过暴露的Jagged1激活GSCs中的NOTCH1-SOX2正反馈环路,从而为GSCs提供生存优势。该正反馈环路可作为胶质瘤的治疗靶标。主要结果如下:1.胶质瘤瘤周组织标本中GSCs沿白质神经纤维分布（1）对胶质瘤瘤周组织标本行CD133、Tau1免疫荧光染色并定量分析。结果显示,49.5%的CD133⁺细胞与神经纤维之间的距离在5μm之内。（2）透射电镜观察胶质瘤瘤周组织,发现瘤周白质神经纤维损伤明显（膨胀、断裂）,更为重要的是,部分白质神经纤维发生脱髓鞘改变。（3）对胶质瘤瘤周组织标本进行Tau1/NF200、MBP免疫荧光染色并行共定位定量分析。结果显示,Tau1/NF200和MBP的信号未完全重叠,部分Tau1/NF200阳性信号外无MBP阳性信号包绕;Tau1/NF200与MBP之间的Rr值0.761,R值0.811?,k1值0.895,k2值0.757,m1值0.884,m2值0.723?。结果提示,部分白质神经纤维发生了脱髓鞘改变。2.激活的Notch信号通路促进GSCs沿白质神经纤维分布（1）对体外培养的神经元进行Tau1、Jagged1免疫荧光染色,结果显示神经元共表达Jagged1和Tau1。（2）对胶质瘤瘤周组织标本行Tau1/Jagged1、CD133/Notch1以及NF200/Notch1免疫荧光染色并定量分析。结果显示,Tau1⁺的白质神经纤维上共表达Jagged1信号,CD133⁺的胶质瘤细胞共表达Notch1信号;Notch1⁺的胶质瘤细胞散在分布于NF200⁺的白质神经纤维周围。其中,54.9%的Jagged1⁺的信号与神经纤维的距离在5μm内;CD133与Notch1之间Rr值0.638,R值0.692?,k1值0.593?,k2值0.853,m1值0.608,m2值1.067?;24.4%的Notch1⁺细胞与白质神经纤维的距离在5μm之内。结果提示,胶质瘤瘤周组织的白质神经纤维表达Jagged1,CD133⁺Notch1⁺的GSC沿着NF200⁺的白质神经纤维散在分布。（3）将成球培养的GL261-NOTCH1^KD和GL261-NOTCH1^MOCKOCK GSC分别移植到Thy1-EGFP转基因小鼠右侧纹状体旁接近胼胝体处。植入后第2、4周分别进行激光共聚焦显微镜检测。结果显示,植入2周后,对照组(GL261-NOTCH1^MOCK组)可见少量CD133⁺胶质瘤细胞沿着白质神经纤维侵袭,而敲低组(GL261-NOTCH1^KD组)相同区域罕见胶质瘤细胞。定量分析结果显示,对照组侵入白质神经纤维的胶质瘤细胞数以及CD133⁺的胶质瘤细胞数分别为16和9,明显高于敲低组（分别为4和4）。原位移植4周后,对照组小鼠在脑中线、同侧和对侧海马等多处观察到肿瘤组织的形成;敲低组仅在植入部位附近观察到肿瘤的生长。结果提示,下调GSC细胞Notch1的表达,可以显著抑制GSC沿着白质神经纤维侵袭。3.Notch1通过Sox9上调SOX2的转录（1）利用TCGA（The Cancer Genome Atlas）以及GEO（Gene expression omnibus）数据库,通过Pearson相关系数评估SOX2的表达量与干性分数和NOTCH1表达量的相关性。结果显示,SOX2的表达量与干性分数和NOTCH1表达量显著正相关。（2）对胶质瘤瘤周组织样本行Sox2/NF200和Sox9/NF200免疫荧光染色并定量分析。结果显示,Sox2⁺和Sox9⁺的胶质瘤细胞均散在分布于NF200⁺白质神经纤维周围;其中,93.1%的Sox2⁺细胞与白质神经纤维的距离在5μm之内,72%的Sox9⁺细胞与白质神经纤维的距离在5μm之内。提示,白质神经纤维附近的胶质瘤细胞中表达Sox2和Sox9。（3）对成球培养的GSCs进行Notch1、Sox9和Sox2免疫荧光染色,结果显示,GSCs中共表达Notch1、Sox9和Sox2蛋白。（4）干预原代胶质母细胞瘤细胞（GBM1和GBM2）和胶质瘤细胞系U87中NOTCH1的表达,RT-PCR和Western-blot检测其对SOX2表达的影响。结果显示,NOTCH1可以正向调控Sox2的表达。干预GBM1中SOX9的表达,Western-blot检测其对Sox2表达的影响。结果显示,干预SOX9可逆转过表达NOTCH1所引起的Sox2表达变化。（5）染色质免疫共沉淀和凝胶迁移实验检测结果显示,Sox9可与SOX2启动子区域（Site1-3位点）结合。4.Sox2通过调控Notch1促进GSC沿着白质神经纤维分布（1）干预GBM1/2和U87中SOX2的表达,RT-PCR和Western-blot检测其对NOTCH1表达的影响。结果显示,SOX2可以正向调控NOTCH1的表达。（2）将GBM3-NOTCH1^KD和GBM3-NOTCH1^MOCK细胞分别移植到NOD/SCID小鼠右侧纹状体旁接近胼胝体处,并于植入后第4周进行激光共聚焦显微镜检测。结果显示,植入4周后,对照组(GBM3-NOTCH1^MOCK组)小鼠在脑中线、同侧和对侧海马等多处观察到Sox2⁺肿瘤细胞的生长,而敲低组(GBM3-NOTCH1^KD组)仅在植入部位附近观察到肿瘤的生长。定量分析结果显示,对照组侵入白质神经纤维的胶质瘤细胞数以及Sox2⁺的胶质瘤细胞数分别为158和156,而敲低组分别为13和12。将DTI检测结果导入软件TrackVis软件进行ROI区域的纤维束重建,获得小鼠脑组织FA图及神经纤维束重建图,并与免疫荧光全玻片扫描成像结果进行拟合。结果显示,Sox2⁺的胶质瘤细胞沿着重建的白质神经纤维分布。上述结果说明,敲低Notch1可以抑制Sox2⁺胶质瘤细胞沿着白质神经纤维侵袭。5.SOX2通过TET3上调NOTCH1的转录（1）甲基化抑制剂5-Aza处理GBM2后,甲基化DNA免疫共沉淀-PCR检测NOTCH1启动子区域甲基化程度,RT-PCR和Western-Blot检测NOTCH1的表达水平。结果显示,SOX2对NOTCH1启动子甲基化水平的下调以及NOTCH1转录水平的上调均可以被5-Aza回复。（2）在过表达SOX2的GBM2(GBM2-SOX2^OE)细胞中敲低TET3的表达后,RT-PCR检测NOTCH1的表达水平,MeDIP-qPCR检测NOTCH1启动子的甲基化水平。结果显示,敲低TET3可回复SOX2过表达所诱导的NOTCH1转录上调和NOTCH1启动子甲基化的下调。本研究的主要结论包括:1.CD133⁺GSCs优先分布白质神经纤维附近。其中,脱髓鞘白质神经纤维暴露的Jagged1和GSCs表面Notch1的相互作用可能是这种空间分布的决定因素。2.Notch1通过Sox9作用于SOX2基因转录启动子区域site1-3位点进而上调SOX2的转录。3.Sox2通过TET3降低NOTCH1基因启动子CpG岛的甲基化水平进而上调NOTCH1的转录。综上,本研究发现,在胶质瘤瘤周组织中,脱髓鞘白质神经纤维暴露的Jagged1和临近GSCs表面Notch1的相互作用,激活了GSCs中的NOTCH1-SOX2正反馈调节环路,从而促进GSCs沿着白质神经纤维侵袭;干扰正反馈调节环路中的NOTCH1可以抑制GSCs沿着白质神经纤维侵袭。上述结果揭示了NOTCH1-SOX2正反馈环路在调控GSCs沿白质神经纤维侵袭中的重要作用,并为抗胶质瘤侵袭提供了新的治疗靶标。