研究背景子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是指子宫内膜腺体和间质出现在卵巢、腹膜等子宫腔以外的部位,它的主要临床症状是痛经、慢性盆腔痛、性交困难和不孕症等。EMs是育龄期女性最常见的妇科疾病之一,累及约10%的育龄期妇女,而在不孕症的女性中EMs发病率高达35-50%。目前针对EMs的发病机制提出了很多假说,但每种学说都不能完全解释EMs的临床特征,因此EMs的发病机制仍不明确。此外,由于缺乏有效诊断EMs的无创标志物,导致EMs诊断延时,从而影响治疗效果。综上,进一步筛选EMs的无创诊断标志物和研究EMs的发病机制,对于EMs的早期诊断和优化治疗策略尤为关键。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约22-24个核苷酸的内源性非编码小RNA,通过与靶向mRNA的3’UTR结合来调节其翻译过程。目前研究已证实外周血液中miRNA可作为多种疾病的无创诊断标志物,但是这些miRNA容易受到RNA酶的影响,浓度不稳定。外泌体(exosomes,exo)是一种直径约为50-150nm的膜性胞外囊泡,广泛分布在尿液、血液、脑脊液及其他体液中。几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体。外泌体内含有蛋白质、脂类、miRNA等多种生物活性分子,可被相邻或远处细胞摄取,从而调节受体细胞的功能。因此外泌体可作为不同细胞之间生物通信的桥梁。外泌体中的miRNA不易受到RNA酶的影响,浓度相对稳定。目前研究认为外泌体miRNA参与多种疾病的发生发展并可作为疾病的诊断标志物。然而,关于外泌体miRNA在EMs中的诊断价值及其作用机制尚缺乏探究。目前研究认为免疫细胞在EMs的起源和发展中发挥重要作用,其功能障碍是导致异位子宫内膜清除不良的重要原因。腹腔微环境中的免疫细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。这些免疫细胞的功能异常引起异位内膜细胞的增殖、迁移和侵袭以及异位病灶内血管生成,从而促进EMs的发生发展。研究表明EMs患者腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages,pMφ)的数目、浓度和活化状态均升高。腹腔巨噬细胞通过分泌IL-10和TGF-β等细胞因子,作用于异位子宫内膜间质细胞(ectopic endometrial stromal cells,eESCs),导致 EMs 进展。既往在其他疾病中已经证实腹腔巨噬细胞通过释放外泌体miRNA进入周围微环境,影响受体细胞的增殖、浸润等一系列过程。但是目前国内外尚无有关腹腔巨噬细胞来源的外泌体miRNA在EMs中的作用机制研究。本研究以外泌体miRNA为切入点,寻找EMs的新型无创诊断标志物,深入探究腹腔巨噬细胞来源的外泌体miRNA在EMs中的作用机制,为EMs的诊断和治疗提供新的思路。本研究分为两部分,在第一部分中我们检测了 EMs患者血清外泌体miRNA的表达谱,评估了血清外泌体miRNA作为EMs诊断标志物的潜在价值,发现血清外泌体miR-22-3p和miR-320a可作为EMs的无创诊断标志物。在第二部分中我们检测了 miR-22-3p和miR-320a在EMs腹腔巨噬细胞来源外泌体中的表达水平,探究腹腔巨噬细胞通过外泌体影响异位子宫内膜间质细胞生物学行为的作用机制,结果发现腹腔巨噬细胞来源的外泌体miR-22-3p通过调控SIRT1/NF-κB信号通路促进异位子宫内膜间质细胞的增殖、迁移和侵袭。第一部分血清外泌体miRNA作为子宫内膜异位症诊断标志物的研究目的筛选EMs血清外泌体与对照组血清外泌体的差异性miRNA,评估血清特异性外泌体miRNA作为EMs诊断标志物的价值及其与临床病理特征之间的关系,为诊断EMs提供更加准确的标志物。方法1.采用超速离心法从EMs患者和对照组患者血清中分离外泌体,并采用透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析技术(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)和western blot鉴定外泌体。2.采用miRNA基因芯片筛选两组外泌体中差异性miRNA。3.采用qRT-PCR进一步验证外泌体miRNA的表达差异。4.采用ROC曲线分析特异性外泌体miRNA在EMs中的诊断价值。5.采用生物信息学预测特异性外泌体miRNA的靶基因,并进行GO分析和KEGG分析。6.分析特异性外泌体miRNA的表达水平与EMs患者临床病理特征的关系。结果1.血清外泌体的鉴定电镜下观察外泌体呈圆形或椭圆形,中央色淡,边缘清晰,直径介于50-150nm之间。NTA结果显示,大部分颗粒的直径在50-200nm之间,平均直径为93±4.1nm。Western blot显示,外泌体特异性蛋白CD9和CD63在所提取的外泌体中高表达。2.血清外泌体miRNA基因芯片检测结果miRNA基因芯片结果显示,EMs患者和对照组患者血清外泌体中有24个差异性miRNA(P<0.05,|1og2(Fold Change)|≥1),其中18个上调,6个下调。3.血清外泌体差异性miRNA的验证结合miRNA基因芯片的结果和文献回顾,我们选择可能与疾病相关的6种miRNA(miR-134-5p、miR-197-5p、miR-22-3p、miR-320a、miR-494-3p 和 miR-939-5p)进行验证。qRT-PCR结果显示,miR-22-3p和miR-320a在EMs组血清外泌体中的表达水平明显高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05),其余miRNA在两组之间的表达差异没有统计学意义(P>0.05)。4.血清外泌体miR-22-3p和miR-320a在EMs中的诊断价值血清外泌体miR-22-3p用于诊断EMs的ROC曲线下面积(Area Under Curve,AUC)是 0.843(95%CI:0.747-0.940),血清外泌体 miR-320 的 AUC 是 0.824(95%CI:0.721-0.927),血清外泌体 miR-22-3p 联合 miR-320a 的 AUC 是 0.903(95%CI:0.846-0.981),而血清 CA-125 的 AUC 是 0.775(95%CI:0.659-0.891)。5.miR-22-3p和miR-320a靶基因的预测及生物信息学分析用韦恩图表示靶基因预测结果。GO分析发现靶基因功能主要集中于MAPK活性、核纤层蛋白结合、G蛋白偶联谷氨酸受体结合等;KEGG分析发现靶基因主要富集于TNF信号通路、催乳素信号通路、ErbB信号通路等。6.血清外泌体miR-22-3p和miR-320a的表达水平与EMs患者临床病理特征的相关性血清外泌体miR-22-3p和miR-320a的表达水平都与EMs临床分期呈正相关(P<0.05),血清外泌体miR-320a的表达水平与痛经严重程度呈正相关(P<0.05)。其他指标与血清外泌体miR-22-3p和miR-320a的表达水平无相关性(P>0.05)。结论1.血清外泌体miR-22-3p和miR-320a有望作为EMs的无创诊断标志物,具有较高的诊断效能。2.血清外泌体miR-22-3p和miR-320a的表达水平都与EMs临床分期呈正相关,血清外泌体miR-320a的表达水平还与痛经严重程度呈正相关。第二部分腹腔巨噬细胞来源外泌体miR-22-3p通过调控SIRT1/NF-κB信号通路促进异位子宫内膜间质细胞增殖、迁移和侵袭的研究目的检测miR-22-3p和miR-320a在EMs腹腔巨噬细胞来源外泌体(EMs exosomes)和对照组腹腔巨噬细胞来源外泌体(controlexosomes)中的表达差异。探究腹腔巨噬细胞通过外泌体miR-22-3p影响异位子宫内膜间质细胞生物学行为的机制。方法1.从两组患者腹水中分离并培养腹腔巨噬细胞,采用超速离心法从细胞上清中分离外泌体,并采用透射电子显微镜、NTA和western blot鉴定外泌体。2.分离异位内膜间质细胞,并与Dil标记的外泌体共孵育,免疫荧光显微镜下观察腹腔巨噬细胞来源的外泌体被异位内膜间质细胞摄取的情况。3.采用CCK-8、EdU实验、划痕实验、Transwell实验和流式细胞术检测两组外泌体对异位内膜间质细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。4.采用qRT-PCR检测两组外泌体中miR-22-3p和miR-320a的表达情况,以及与不同外泌体共孵育后异位内膜间质细胞中miR-22-3p和pri-miR-22-3p的表达水平。5.采用qRT-PCR检测不同内膜间质细胞和内膜组织中miR-22-3p的表达水平。6.采用CCK-8、EdU实验、划痕实验、Transwell实验和流式细胞术检测miR-22-3p对异位内膜间质细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。7.采用TargetScan预测miR-22-3p的靶基因,并采用双荧光素酶报告基因实验检测SIRT1和miR-22-3p的结合关系。8.采用免疫组化及western blot检测不同内膜中SIRT1的蛋白表达水平。采用CCK-8、划痕实验和Transwell实验检测SIRT1对异位内膜间质细胞增殖、迁移和侵袭的影响。9.采用CCK-8、划痕实验和Transwell实验检测SIRT1逆转miR-22-3p对内膜间质细胞增殖、迁移和侵袭的影响。10.采用免疫组化及western blot检测不同内膜中NF-κB相关蛋白p-p65的表达水平;采用western blot检测SIRT1过表达和SIRT1 siRNA对p-p65表达水平的影响。采用CCK-8、划痕实验和Transwell实验检测NF-κB抑制剂PDTC对异位内膜间质细胞增殖、迁移和侵袭的影响。11.采用CCK-8、划痕实验和Transwell实验检测PDTC逆转miR-22-3p对异位内膜间质细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果1.腹腔巨噬细胞及其分泌的外泌体的鉴定免疫荧光和流式细胞术结果显示,EMs组和对照组腹腔巨噬细胞均高表达CD68。透射电子显微镜下外泌体的形态呈圆形或椭圆形,直径在50-150nm之间。通过NTA证实外泌体的平均直径为105±3.9nm。Western blot结果显示,本研究所分离的外泌体高表达CD9和CD63。2.异位内膜间质细胞摄取腹腔巨噬细胞来源的外泌体用Dil染料标记外泌体,然后与异位内膜间质细胞共孵育,免疫荧光显微镜观察到异位内膜间质细胞核外见红色颗粒。3.腹腔巨噬细胞来源的外泌体对异位内膜间质细胞生物学行为的影响免疫荧光结果显示异位内膜间质细胞内Vimentin表达呈阳性。CCK-8、EdU实验、划痕实验、Transwell实验和流式细胞术结果显示,孵育EMs exosomes后异位内膜间质细胞的增殖、迁移和侵袭能力较对照组均明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),两组外泌体对细胞凋亡影响的差异无统计学意义(P>0.05)。4.腹腔巨噬细胞通过外泌体途径将miR-22-3p转运至异位内膜间质细胞qRT-PCR 结果显示,EMs exosomes 中 miR-22-3p 的表达水平较 control exosomes明显升高(P<0.05)。两组外泌体中miR-320a的表达水平无明显差异(P>0.05)。与EMs exosomes共孵育后,异位内膜间质细胞中miR-22-3p的表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而pri-miR-22-3p的表达水平没有明显差异(f>0.05)。5.miR-22-3p在不同内膜间质细胞以及不同内膜中的表达差异异位内膜间质细胞中miR-22-3p的表达水平明显高于在位内膜间质细胞和正常内膜间质细胞,差异均具有统计学意义(P<0.05)。异位内膜中miR-22-3p的表达水平明显高于在位内膜和正常内膜,差异均具有统计学意义(P<0.05)。6.miR-22-3p对异位内膜间质细胞生物学行为的影响qRT-PCR结果显示,与对照组相比,miR-22-3p mimics和inhibitors分别明显上调和下调异位内膜间质细胞内miR-22-3p的表达水平,差异均具有统计学意义(P<0.05)。CCK-8、EdU实验、划痕实验、Transwell实验和流式细胞术结果显示,miR-22-3p mimics明显提高异位内膜间质细胞的增殖、迁移和侵袭能力,miR-22-3pinhibitors明显抑制异位内膜间质细胞的增殖、迁移和侵袭能力,差异均具有统计学意义(P<0.05),miR-22-3p mimics和inhibitors对细胞凋亡影响的差异无统计学意义(P>0.05)。7.miR-22-3p靶基因的预测及验证TargetScan预测SIRT1的3’UTR存在miR-22-3p的结合位点,位于530-537位点。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-22-3p能够与SIRT1 3’UTR特异性结合。Western blot和qRT-PCR均显示,与对照组相比,miR-22-3p mimics和inhibitors分别明显下调和上调SIRT1的蛋白表达水平和mRNA表达水平,差异均具有统计学意义(P<0.05)。8.SIRT1对异位内膜间质细胞生物学行为的影响免疫组化及western blot结果均显示,异位内膜中SIRT1的蛋白表达水平明显低于在位内膜和正常内膜。CCK-8、划痕实验和Transwell实验分别显示,与对照组相比,SIRT1 siRNA明显增加异位内膜间质细胞的增殖、迁移和侵袭能力,SIRT1过表达明显抑制异位内膜间质细胞的增殖、迁移和侵袭能力,差异均具有统计学意义(P<0.05)。9.SIRT1过表达逆转miR-22-3p对异位内膜间质细胞生物学行为的影响CCK-8、划痕实验和Transwell实验结果分别显示,与转染miR-22-3p mimics组和转染miR-22-3p mimics+SIRT 1对照载体组相比,转染miR-22-3p mimics+SIRT1过表达载体组异位内膜间质细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。10.SIRT1通过调控NF-κB信号通路影响异位内膜间质细胞的生物学行为免疫组化及western blot结果均显示异位内膜中p-p65的表达水平明显高于在位内膜和正常内膜。Western blot结果显示,过表达SIRT1明显降低异位内膜间质细胞中p-p65的表达水平,而SIRT1 siRNA明显提高p-p65的表达水平。CCK-8、划痕实验和Transwell实验结果分别显示,NF-κB抑制剂PDTC明显抑制异位内膜间质细胞的增殖、迁移和侵袭能力,差异均具有统计学意义(P<0.05)。11.PDTC逆转miR-22-3p对异位内膜间质细胞生物学行为的影响Western blot结果显示miR-22-3p mimics明显提高p-p65的表达水平,而miR-22-3p inhibitors明显降低p-p65的表达水平。CCK-8、划痕实验和Transwell实验结果显示,与转染miR-22-3p mimics组相比,转染miR-22-3p mimics+PDTC组异位内膜间质细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论1.EMs腹腔巨噬细胞来源外泌体能够被异位内膜间质细胞摄取,进而促进异位内膜间质细胞的增殖、迁移和侵袭。2.miR-22-3p在EMs腹腔巨噬细胞来源外泌体中高表达,可通过外泌体途径转运至异位内膜间质细胞。3.miR-22-3p通过靶向调控SIRT1,激活NF-κB,进而影响异位内膜间质细胞的生物学行为。