研究背景肾癌是成人最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一。最新国家癌症调查数据显示,肾癌发病率约占所有癌症发病率的5%,且呈逐年上升趋势。肾透明细胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)是肾癌最主要的病理类型。得益于健康体检的普及和影像技术的不断进步,早期发现的肾癌越来越多,但约30%的患者一经确诊就转移了。目前,手术被认为是治疗早期肾癌最重要、最有效的方法。但仍有20%-30%的肿瘤患者术后出现复发或远处转移。肾透明细胞癌对化疗、放疗均不敏感,而且转移性肾透明细胞癌患者预后极差,五年生存率不足10%。因此,探索肾透明细胞癌侵袭转移的机制,寻找KIRC理想的肿瘤学标志物和有效的治疗靶点对于此类患者的早期诊断,提高患者的治愈率和总生存率,改善KIRC患者的预后,显得迫切而重要。近年来,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在肿瘤的作用受到越来越多的关注,研究发现LncRNA可作为癌基因或抑癌基因的转录调控分子参与肿瘤的增殖、迁移、侵袭、转移、以及诱导肿瘤耐药、免疫逃逸等多种过程。我们通过生物信息学分析,筛选出一个新的长链非编码RNALINC00997,在肾透明细胞癌组织中和癌旁正常肾组织中差异性表达,且与患者的临床分期和生存预后密切相关。本课题遂从长链非编码RNA LINC00997着手,研究了其对肾透明细胞癌侵袭转移功能的影响,发现长链非编码RNA LINC00997的表达水平与肾透明细胞癌的侵袭转移密切相关。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮细胞向间质细胞分化时显著改变其形态和运动行为的过程。在肿瘤细胞的EMT过程中,波形蛋白(VIM,Vimentin)和基质金属蛋白酶(MMPs,Matrix metalloprateinase)等的表达增强,肿瘤细胞获得了抗凋亡及降解细胞外基质的能力、细胞迁移能力增加,最终导致了肿瘤的浸润和转移。上皮间质转化在包括肾细胞癌在内的众多恶性肿瘤的侵袭转移中扮演着重要的角色。我们推测长链非编码RNA LINC00997可能通过上皮间质转化介导肾癌侵袭转移。S100A11是S100蛋白家族中重要的细胞调控因子之一,可参与肿瘤增殖、侵袭、转移、免疫逃逸等多种过程,且与胶质母细胞瘤、肝内胆管癌等肿瘤的上皮间质转化相关,S100A11是否会是长链非编码RNA LINC00997介导上皮间质转化的靶基因呢?为了验证我们的假设,我们首先通过生物信息学预测长链非编码RNA LINC00997和S100A11、EMT相关分子(VIM、MMP2和MMP7)的相互表达关系,随后设计了一系列的RNA干扰实验,证实了其在肾透明细胞癌细胞中的表达情况和生物学功能。为进一步研究长链非编码RNA LINC00997调控S100A11的分子机制,我们通过生物信息学分析和双荧光素酶报告实验验证了长链非编码RNA LINC00997与S100A11启动子的靶向关系,并证实STAT3是S100A11的转录因子。然后通过RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RNA binding proteinimmunoprecipitation,RIP)证实了长链非编码RNA LINC00997可结合STAT3,RNA干扰实验再次确认了长链非编码RNA LINC00997和转录因子STAT3的靶基因为S100A11。最终揭示长链非编码RNALINC00997调控肾透明细胞癌细胞侵袭转移的相关分子机制,为肾透明细胞癌提供了潜在的肿瘤学标志物和药物治疗靶点。第一部分长链非编码RNA LINC00997在肾透明细胞癌中的表达及临床意义目的验证长链非编码RNA LINC00997在原发性肾透明细胞癌组织和癌旁正常肾组织的表达差异,以及在人肾透明细胞癌细胞系786-O和人肾小管上皮细胞系HKC中的表达差异,并分析其与患者远处转移、临床分期和生存预后的关系,为进一步研究长链非编码RNALINC00997在肾透明细胞癌中的功能和调控机制提供依据。方法1.检索GEPIA数据库,分析长链非编码RNALINC00997的表达情况,并分析其与肾透明细胞癌患者远处转移、临床分期和生存预后的关系。2.收集郑州大学第一附属泌尿外科2017年6月至2018年12月间行肾癌根治性切除术的18例肾透明细胞癌患者标本,同时收集此18例患者的临床资料,包括远处转移情况和TNM分期。所有的纳入标本均经过郑州大学第一附属医院病理科专家再次确认,所有实验材料包括术后的肿瘤及瘤旁组织的获得及进一步实验均征得患者知情同意,并通过郑州大学第一附属医院伦理委员会批准。qRT-PCR检测肾透明细胞癌组织及配对的癌旁正常组织中LINC00997的表达水平。3.检测肾透明细胞癌细胞系786-O和人肾小管上皮细胞系HKC中长链非编码RNA LINC00997的表达水平。结果1.通过生物信息学分析(GEPIA),长链非编码RNALINC00997在多种肿瘤中表达上调,其中包括肾透明细胞癌(kidney renal cell carcinoma,KIRC)、肾乳头状细胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP)、前列腺癌(prostateadenocarcinoma,PAAD)等。Ⅲ期和Ⅳ期的肾透明细胞癌患者中长链非编码RNA LINC00997明显表达上调(P<0.05)。Kaplan—Meier生存曲线显示长链非编码RNA LINC00997高表达的患者总生存期和无瘤生存期均显著低于低表达组(Logrank P=0.0062;Logrank P=1.8e-06)。2.18名肾透明细胞癌患者中癌组织的长链非编码RNA LINC00997表达量显著高于癌旁正常肾组织,合并远处转移的患者表达显著高于无转移患者,Ⅲ期和Ⅳ期的患者表达显著高于Ⅰ期和Ⅱ期的患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.长链非编码RNA LINC00997在人肾透明细胞癌细胞系786-O中的表达量明显高于人肾小管上皮细胞系HKC,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论长链非编码RNA LINC00997在肾透明细胞癌组织和786-O细胞系中呈现高表达趋势,并与肾透明细胞癌患者的远处转移、临床分期和生存预后具有显著的相关性。本部分的实验结果为进一步研究长链非编码RNALINC00997在肾透明细胞癌中的作用奠定了基础,也为后续探索长链非编码RNA LINC00997调控肾透明细胞癌侵袭转移的机制做铺垫。第二部分 长链非编码RNA LINC00997调控肾透明细胞癌的生物学功能研究目的为了进一步研究长链非编码RNALINC00997在肾透明细胞癌侵袭转移和上皮间质转化中的作用,在这一部分,我们设计了一系列的RNA干扰实验,验证了长链非编码RNA LINC00997和S100A11、EMT相关分子(VIM、MMP2和MMP7)的相互表达关系和相关的生物学功能。为进一步深入揭示长链非编码RNA LINC00997调控肾透明细胞癌的分子机制奠定基础。方法1.检索GEPIA数据库,预测长链非编码RNALINC00997和S100A11的表达关系,并进一步预测S100A11在肾透明细胞癌中的表达水平,分析其与肾透明细胞癌患者临床分期和生存预后的关系。2.qRT-PCR检测18例肾透明细胞癌患者癌组织及配对的癌旁正常组织中S100A11的表达情况,并分析其与肾透明细胞癌患者远处转移和临床分期的关系。3.体外细胞培养人肾透明细胞癌细胞系786-O,siRNA技术靶向沉默长链非编码RNALINC00997和S100A11的表达。细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测肾透明细胞癌细胞的划痕修复能力和细胞迁移能力。4.检索GEPIA数据库,预测长链非编码RNA LINC00997和S100A11的表达水平与EMT相关分子VIM、MMP2、MMP7的关系。5.沉默长链非编码RNA LINC00997和S100A11的表达,qRT-PCR分别检测EMT相关分子VIM、MMP2、和MMP7的表达情况。结果1.通过生物信息学分析,S100A11和长链非编码RNA LINC00997的表达呈正相关。S100A11在包括肾透明细胞癌的多种肿瘤中表达明显上调(P<0.05)。S100A11在Ⅲ期和Ⅳ期的肾透明细胞癌患者中表达明显升高(Pr<0.05)。Kaplan—Meier生存曲线显示S100A11高表达的患者总生存期和无瘤生存期均显著低于低表达组(Logrank P=1.1 e-05;Logrank P=4e-04)。2.肾透明细胞癌患者中癌组织的S100A11表达量显著高于癌旁正常组织,合并远处转移患者的表达显著高于无转移患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.划痕修复试验显示:沉默长链非编码RNA LINC00997或S100A11后,786-O细胞的划痕愈合能力明显低于阴性对照组(P<0.05)。细胞Transwell迁移实验显示:沉默长链非编码RNA LINC00997或S100A11后,细胞的迁移能力显著低于阴性对照组(P<0.05)。4.生物信息学分析显示:长链非编码RNA LINC00997和S100A11与EMT相关分子VIM、MMP2、MMP7均呈正相关。5.RNA干扰试验显示:沉默长链非编码RNALINC00997或S100A11的表达均可显著降低EMT相关分子VIM、MMP2和MMP7的表达。结论1.长链非编码RNA LINC00997和S100A11在肾透明细胞癌中的表达密切相关。2.S100A11在肾透明细胞癌中高表达,并且与肾透明细胞癌患者的远处转移、临床分期和生存预后具有显著的相关性。3.长链非编码RNA LINC00997和S100A11可调节肾透明细胞癌细胞系786-O的侵袭迁移能力。4.长链非编码RNA LINC00997和S100A11可调节VIM、MMP2和MMP7表达。第三部分 长链非编码RNA LINC00997参与肾透明细胞癌转移的分子机制研究目的探索LINC00997与S100A11的靶向关系,揭示LINC00997调控肾透明细胞癌细胞侵袭转移的具体分子机制。方法1.生物信息学分析预测:检索LncTar数据库,预测长链非编码RNA LINC00997和S100A11启动子的关系。检索JASPAR数据库和hTFtarget数据库预测S100A11启动子和转录因子STAT3的关系。检索LNCPRO数据库,预测长链非编码RNA LINC00997和STAT3蛋白的关系。2.构建S100A11启动子的荧光素酶报告基因质粒,将其和si-LINC00997或阴性对照分别转染至HEK293细胞。双荧光素酶报告实验检测si-LINC00997组和阴性对照组的荧光素酶活性。3.构建S100A11启动子的3种荧光素酶报告基因质粒,包括S100A11S-pro-wt、100A11-pro-1mut和S100A11-pro-2mut。将这些荧光素酶质粒和si-STAT3或阴性对照转染至HEK293细胞,双荧光素酶报告基因实验分别检测si-STAT3组和阴性对照组的荧光素酶活性。4.RNA结合蛋白免疫沉淀技术(RIP)检测长链非编码RNALINC00997与STAT3的相互作用。5.利用siRNA技术,分别沉默长链非编码RNALINC00997和STAT3的表达后,qRT-PCR检测人肾透明细胞癌细胞系786-O中S100A11的表达情况。结果1.检索LncTar数据库,发现长链非编码RNALINC00997和S100A11启动子存在结合位点。检索JASPAR数据库和hTFtarget数据库,发现S100A11启动子和STAT3蛋白有两个潜在的结合位点。检索LNCPRO数据库,发现长链非编码RNA LINC00997具有潜在结合STAT3蛋白的能力。2.沉默长链非编码RNA LINC00997显著降低了S100A11启动子的荧光素酶活性,差异有统计学意义(P<0.05)3.沉默STAT3显著抑制了S100A11启动子野生型和Ⅱ型突变型的荧光素酶活性(P<0.05),S100A11启动子I型突变型的荧光素酶活性与对照组无显著差异。4.RIP实验证实长链非编码RNALINC00997可与STAT3蛋白相互结合。5.干扰长链非编码RNA LINC00997或STAT3的表达可抑制786-O细胞S100A11的表达。结论:1.长链非编码RNA LINC00997可靶向调节S100A11的表达。2.STAT3可靶向结合S100A11的启动子,促进S100A11的转录。3.长链非编码RNA LINC00997具有与STAT3蛋白结合的能力。4.长链非编码RNA LINC00997可通过与STAT3蛋白结合,靶向调节S100A11的表达。