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近几年由南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)引起的南方水稻黑条矮缩病在我国南方稻区流行,对水稻生产造成了严重的损失。SRBSDV由白背飞虱(Sogatella furcifera,Horvath)以持久增殖型方式传播,两者具有极高的亲和性。已知SRBSDV编码的非结构蛋白P7-1形成包裹病毒粒体的管状结构,是病毒在介体白背飞虱体内突破各种屏障并快速扩散的重要通道,而病毒的扩散必然需要介体因子的参与才能完成,因此筛选与P7-1互作的介体蛋白将有助于研究SRBSDV与白背飞虱高度亲和的分子机制。为此,本研究首先采用酵母双杂交系统,以SRBSDV非结构蛋白P7-1为诱饵,初步从带毒白背飞虱cDNA文库中筛选出与P7-1互作的介体因子63个。经过序列分析及功能预测,挑选出6个可能与P7-1互作的候选蛋白进一步验证。通过双分子荧光互补实验(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)在共聚焦显微镜下观察到有5个候选蛋白与P7-1互作产生黄色荧光,这5个蛋白分别是 B-cell receptor-associated protein 31-like(BAP31)、Ly-6/neurotoxin superfamily member 1(Neurotoxin)、DNA-J/hsp40 protein(DNA J)、ubiquitin-protein E3 ligase(E3)和 myosin RLC2(Myosin),而 skeletal muscle growth protein 5(Skeletal)与P7-1不产生荧光,两者不发生互作,其中P7-1与BAP31会在细胞膜和细胞质形成大量的颗粒状和囊泡状聚集体,P7-1与DNAJ或Myosin也可以在细胞膜的周围形成大量小的颗粒状聚集物;通过共定位实验观察到BAP31、Neurotoxin、DNA J和E3均与P7-1在本氏烟中能发生共定位,而Skeletal与P7-1不发生共定位。然后,利用昆虫杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中验证了 P7-1与BAP31、Neurotoxin、DNAJ、E3和Myosin 5个候选蛋白之间的互作方式。单独表达时,P7-1形成小管状结构,并可以伸出细胞膜外;BAP31形成囊泡状结构;Neurotoxin在细胞质中形成小颗粒和弥散状蛋白,紧贴在细胞核的周围;DNAJ在细胞质中形成大的颗粒状结构;E3在细胞质中形成较少的小颗粒结构;Myosin会弥散在整个细胞质中并沿着细胞膜伸出伪足。当P7-1分别与候选蛋白在Sf9细胞中共同表达时,BAP31形成的囊泡状结构消失,分布在P7-1周围并将管状结构拘束在细胞质中;Neurotoxin形成更多的颗粒状结构,而P7-1小管蛋白分布在Neurotoxin颗粒状结构的周围;DNAJ被P7-1招募,不再形成颗粒状结构,而是与P7-1一起形成管状结构并伸出细胞膜外;E3颗粒状结构与P7-1蛋白形成的管状结构部分发生共定位,分布在管状结构的周围;此外,当BAP31与Neurotoxin在Sf9细胞中共表达时,BAP31不再形成囊泡状结构,而是形成颗粒状结构与Neurotoxin蛋白在细胞质中发生共定位。以上结果表明P7-1与BAP31、Neurotoxin、DNAJ、E3及Myosin均会在Sf9细胞中发生互作,且BAP31与Neurotoxin两者也可以发生互作。为了进一步明确候选互作蛋白对SRBSDV在白背飞虱体内侵染扩散的作用,通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在介体白背飞虱体内分别抑制候选互作蛋白(BAP31、Neurotoxin、DNAJ和Myosin)的表达。结果发现干扰BAP31后,SRBSDV的管状蛋白基因P7-1和外壳蛋白基因P10的在虫体内表达量会明显的高于对照组;干扰Neurotoxin、DNA J和Myosin基因后,P7-1和P10基因的在虫体内表达量均会明显低于对照组。在带毒白背飞虱体内Neurotoxin、DNAJ、E3和Myosin的表达量比健康虫体内的表达量高,而BAP31在毒虫体内的相对表达量降低了,推测蛋白Neurotoxin、DNAJ、E3和Myosin可能在介体体内有助于P7-1管状蛋白形成和扩散,有利于病毒在介体体内的侵染;而BAP31可能参与白背飞虱体内抗病毒免疫途径,会抑制病毒和管状结构的扩散。综上所述,本研究通过酵母双杂交筛选到63个与SRBSDV编码的P7-1管状结构互作的候选互作蛋白,并通过BiFC、本氏烟中共定位和杆状病毒表达系统证明了 5 个候选蛋白(BAP31、Neurotoxin、DNAJ、E3和 Myosin)与 P7-1存在互作关系,最后通过dsRNA诱导的RNAi技术明确了候选互作蛋白在病毒的扩散过程中发挥功能,但具体机制还有待进一步研究。本研究为解析SRBSDV与介体昆虫间的互作机制奠定了基础。