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DNase B是A组乙型溶血性链球菌(GAS)的一种分泌蛋白，序列高度保守，几乎存在于所有GAS中，Anti-DNase B检测可作为GAS感染引起的疾病的最佳诊断检测方法。然而DNase B的纯化工艺复杂，获取成本昂贵，因而无法满足大量临床诊断检测的需要。本课题研究工作的目的在于：通过基因工程的途径构建DNase B原核表达载体，并获得DNaSe B高效表达。以寻找低成本、大批量的获得抗原性较强的重组DNaseB的方法，为GAS诊断检测试剂和疫苗的研制打下坚实的基础。
本课题研究设计了获得重组DNase B蛋白的两条实验技术路线：
实验技术路线1：运用PCR技术，从质粒pMOl8一T-DNase B中扩增出0.5 kb截短的ONase B基因片段，将其亚克隆构建新的原核表达载体pET-28a(+)-DNase B，经菌落PCR和酶切鉴定正确后，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导其目的蛋白(约22kd)得到了表达。Western-b10tting试验结果表明：菌体表达的DNase B蛋白能与GAS感染患者的强阳性血清发生特异性的免疫反应。但实验技术路线1获得目的蛋白表达量较低。
实验技术路线2：采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM)，对DNase B活性位点的碱基序列进行突变，获得突变的DNase B基因，TA克隆后测定其核苷酸序列。将其定向克隆入pET-28a(+)载体，构建新的原核表达载体，经菌落PCR和酶切鉴定正确后，转化至大肠杆菌BL21(DE3)。表达菌株经IPTG诱导，SDS-PAGE电泳检测表明，目的蛋白(约29kd)主要以包涵体形式实现了高效表达。包涵体蛋白用不同浓度的尿素洗涤后，溶解于8mo1/L尿素溶液中，经Ni-NTA凝胶亲和层析，得到单一的目的蛋白条带。并且对重组DNase B蛋白进行BCA法定量检测分析。
我们对DNase B融合蛋白进行了免疫学试验。Western-blotting试验结果显示：重组的His-DNase B融合蛋白能够与GAS感染患者的阳性血清发生特异性反应。说明经SDS-PAGE电泳检测的蛋白就是GAS菌的DNase B蛋白。乳胶凝集试验结果显示：用该蛋白抗原致敏的乳胶颗粒能与GAS感染患者的阳性血清发生明显的凝集。ELISA试验结果显示：重组DNase B蛋白的抗原特异性良好。
为了获得大量的DNase B蛋白，我们对DNase B蛋白表达的发酵条件进行了正交试验优化。确定DNase B蛋白高效表达的发酵条件的最佳组合为A2B1C1D3，即接种量2％、诱导OD值0.5、IPTG浓度0.6mM、诱导时间5h。并通过了发酵罐发酵验证，为DNase B蛋白规模化生产奠定了试验基础。