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糖尿病性勃起功能障碍（Diabetes Mellitus-induced Erectile Dysfun-ction,DMED）是高血糖病程中最常见的慢性并发症之一,75%的男性糖尿病患者出现不同程度的勃起功能损伤,并随着病程进展逐渐加重,对男性糖尿病患者及其家庭生活的影响隐匿且复杂,现有治疗药物对DMED治疗效果欠佳。本课题以DMED患者、DMED大鼠和体外培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞（Corpus Cavernosum Smooth Muscle Cells,CCSMCs）研究对象,观察血管紧张素（1-7）[Angiotensin（1-7）,Ang（1-7）]在DMED患者血清中的表达差异,探讨Ang（1-7）改善糖尿病性勃起功能障碍的可能机制,为临床治疗DMED提供理论依据。第一部分血清Ang（1-7）水平与糖尿病性勃起功能障碍的相关性研究目的:探索糖尿病性勃起功能障碍患者血清Ang（1-7）、一氧化氮（Nitric oxide,NO）水平及相关临床意义。方法:选取河北医科大学第二医院内分泌科55例2型糖尿病未罹患勃起功能障碍患者（DM组）、56例DMED患者（DMED组）,体检中心60例勃起功能正常的健康男性（对照组）,检测其血清Ang（1-7）、NO、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量,探讨血清Ang（1-7）水平与临床检测指标的相关性。结果:1.DMED组患者年龄、糖化血红蛋白、TG、CHOL、LDL、尿酸、同型半胱氨酸水平较对照组男性明显升高（P＜0.05）。与DM组比较,DMED组患者糖尿病病程较长,合并心血管疾病的人较多（P＜0.05）。2.与对照组比较,DM组患者血清Ang（1-7）浓度明显减低,MDA含量增加,SOD含量下降（P＜0.05）。DM组患者血清NO较对照组稍降低,差异不显著（P＞0.05）。与DM组比较,DMED组患者血清Ang（1-7）浓度、SOD、NO含量降低,MDA含量升高（P＜0.05）。3.DMED患者血清Ang（1-7）水平与ICP/MAP勃起功能呈正相关（r=0.088,P=0.021）。Ang（1-7）与年龄、BMI、糖尿病病程、冠心病病史、糖化血红蛋白、LDL、HCY呈负相关（P＜0.05）。小结:1.DMED患者的生化指标控制差,心血管危险因素增多,有着更低血清Ang（1-7）水平。2.2型糖尿病男性患者勃起功能障碍可能和血清Ang（1-7）水平降低有关。第二部分Ang（1-7）通过调控DMED大鼠阴茎海绵体NOS水平改善勃起功能的机制研究目的:观察Ang（1-7）对一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase,NOS）的调控及氧化应激状态的影响,探讨其对DMED大鼠勃起功能改善作用的机制。方法:6-9周龄雄性SD大鼠高脂高糖饲料诱导饲养,链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）25mg/kg腹腔注射造模2型糖尿病大鼠,8周后通过阿扑吗啡实验筛选DMED大鼠,分为空白组、糖尿病组、DMED组、DMED-Ang（1-7）干预组、DMED盐水对照组,每组6只大鼠。4周后通过检测海绵体内压（intracavernous pressure ICP）/平均动脉压（mean arterial pressure MAP）评价勃起功能,Western Blot检测阴茎海绵体组织iNOS、p-e NOS/e NOS、p-Akt/Akt表达的差异、酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测血浆中NO、SOD、MDA、过氧亚硝基阴离子（Peroxynitrite,ONOO-）含量变化,免疫荧光观察iNOS、e NOS、p-e NOS表达位置及含量变化。结果:1.Ang（1-7）可调控海绵体组织NOS合成1)Western blot结果显示:与空白组比较,DM组iNOS表达增加,p-e NOS/e NOS下降（P＜0.05）;与DM组比较,DMED组iNOS含量升高,p-e NOS/e NOS显著下降（P＜0.05）。与DMED组比较,Ang（1-7）组iNOS表达显著下降,p-e NOS/e NOS下降（P＜0.05）,但与DM组比较无明显差异（P＞0.05）;盐水对照组与DMED组比较无明显差异（P＞0.05）。与空白组比较,DM组大鼠海绵体Akt磷酸化水平稍降低,DMED大鼠Akt磷酸化水平进一步降低,Ang（1-7）干预组Akt磷酸化水平较DM组、DMED组增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）。盐水对照组与DMED组比较无明显差异（P＞0.05）。2)免疫荧光结果显示:与空白组比较,DM组、DMED组iNOS表达增加,e NOS表达无显著差异,p-e NOS含量下降;与DMED组比较,Ang（1-7）组iNOS表达下降,p-e NOS含量增加,但与DM组比较无显著差异。盐水对照组与DMED组比较无明显差异。2.Ang（1-7）可下调氧化应激损伤ELISA结果显示:与空白组比较,DM组大鼠血浆NO、SOD含量下降,MDA、ONOO-水平升高（P＜0.05）;与DM组比较,DMED组NO、SOD含量下降,MDA、ONOO-水平升高（P＜0.05）。与DMED组比较,Ang（1-7）组大鼠血浆NO、SOD含量升高,MDA、ONOO-水平下降（P＜0.05）。与空白组比较,Ang（1-7）组NO含量稍降低,MDA含量稍增高,但与DM组比较差异不显著;3.Ang（1-7）可改善DMED大鼠勃起功能与空白组比较,DM大鼠ICP/MAP稍降低,可维持正常勃起;DMED组ICP/MAP明显下降,勃起反应迟缓,不能维持正常勃起（P＜0.05）。Ang（1-7）干预组大鼠ICP/MAP较DMED组大鼠升高,可维持正常勃起（P＜0.05）。盐水对照组与DMED组比较无显著差异（P＞0.05）。结论:Ang（1-7）可能通过刺激Akt通路蛋白磷酸化,进一步调控海绵体组织NOS合成,抑制氧化应激损伤,改善DMED大鼠勃起功能。第三部分Ang（1-7）通过Mas/Akt途径调控高糖培养阴茎海绵体平滑肌细胞NOS表达的研究目的:在高糖培养阴茎海绵体平滑肌细胞中观察Ang（1-7）通过Mas/Akt通路调控NOS合成与功能,探讨其抑制氧化应激损伤的可能作用机制。方法:1.高糖培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,设置时间梯度;Ang（1-7）干预高糖培养海绵体平滑肌细胞,设置浓度梯度。Western Blot检测iNOS、p-e NOS/e NOS表达、ELISA法检测培养上清中NO、SOD、MDA、ONOO-含量。2.分别观察敲低iNOS和过表达iNOS对CCSMCs的影响。应用iNOS-si RNA抑制CCSMCs中iNOS表达,分为空白组,高糖组,高糖+Ang（1-7）组,高糖+iNOS-si RNA组,高糖+转染对照组（non-Specific Control,NC）;应用慢病毒转染CCSMCs过表达iNOS,分为空白组,过表达iNOS组,高糖组,高糖+过表达iNOS组,高糖+转染对照组。检测目的及方法同1。并分别收集各组细胞,应用流式细胞术检测各组细胞内钙离子含量。3.分别应用Mas抑制剂A779和Akt通路抑制剂LY294002干预培养细胞,分为空白组,高糖组,高糖+Ang（1-7）组,高糖+Ang（1-7）+A779组,高糖+Ang（1-7）+LY294002组,高糖+溶剂对照（DMSO）组,检测目的及方法同上,并同时检测p-Akt/Akt蛋白表达,流式细胞术检测各组细胞内钙离子含量。结果:1.高糖可刺激iNOS表达,下调p-e NOS/e NOS水平,增加氧化应激损伤,呈时间依赖性,在48h达显著变化（P＜0.05）。Ang（1-7）干预可拮抗高糖培养对CCSMCs影响,下调iNOS表达,上调p-e NOS/e NOS水平,减少氧化应激损伤,呈浓度依赖,10-5mol/l可达显著程度（P＜0.05）。2.与高糖组比较,iNOS-si RNA转染可明显下调iNOS表达（P＜0.05）,但对p-e NOS/e NOS无显著影响,NO合成无明显变化（P＞0.05）;SOD合成增加,ONOO-、MDA含量显著下降（P＜0.05）。与空白组比较,过表达iNOS可明显增加iNOS表达（P＜0.05）,降低p-e NOS/e NOS水平,SOD合成减少,ONOO-、MDA含量显著增加（P＜0.05）,但对NO合成无显著影响（P＞0.05）。Ang（1-7）干预可拮抗过表达iNOS对细胞损伤,增加NO合成,减少氧化应激（P＜0.05）。高糖刺激、过表达iNOS均可显著升高细胞内钙离子含量,慢病毒转染过表达iNOS可进一步升高细胞内钙离子。Ang（1-7）、iNOS-si RNA均可下调高糖培养海绵体平滑肌细胞内钙离子含量（P＜0.05）。3.Mas受体拮抗剂A779（1 mol/l）和Akt拮抗剂LY294002（100 pmol/l）可消除Ang（1-7）对海绵体平滑肌细胞NOS表达及氧化应激的调控作用。高糖刺激、预孵育A779和LY294002均可显著升高细胞内钙离子含量（P＜0.05）。小结:Ang（1-7）可通过Mas/Akt通路下调高糖培养的海绵体平滑肌细胞中iNOS表达,拮抗氧化应激损伤,平衡细胞内钙稳态,协调阴茎海绵体平滑肌舒缩。结论:1.男性2型糖尿病ED患者中血清Ang（1-7）水平与ICP/MAP正相关。2.Ang（1-7）可通过Mas/Akt通路下调高糖培养的海绵体平滑肌细胞中iNOS表达,拮抗氧化应激损伤,平衡细胞内钙稳态,协调阴茎海绵体平滑肌舒缩,改善勃起功能。