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第1部分KH902的溶剂兔眼玻璃体腔注射的初步筛选试验1．目的脉络膜新生血管造成进行性、不可逆的中心视力丧失，目前尚无理想的治疗方法。近来研究发现促血管生长因子水平上调在眼部新生血管性疾病中有重要的作用，其中血管内皮生长因子是最强的促血管新生因子之一。因此，目前研究热点集中在抗VEGF的治疗上。KH902是一种通过玻璃体腔注射给药的新型抗VEGF制剂。本实验观察KH902的6种不同备选溶剂玻璃体腔注射后可能存在的眼部毒性作用，以筛选最佳的溶剂方案。2．方法2．1 15只普通级健康新西兰白兔，随机分为7个组。注药前裂隙灯显微镜及+120D前置镜检查眼前节及眼底，测定眼压，行ERGs检查。0组设为对照组，其余6组玻璃体腔注射等容积的溶剂：溶剂1组为histidine+9％trehalose+0．05％Tween-20；溶剂2组为succinate+9％trehalose+0．05％Tween-20；溶剂3组为PB+0．05％Tween-20；溶剂4组为succinate+9％trehalose+0．05％Tween-20+6％甘露醇：溶剂5组为succinate+9％trehalose+0．05％Tween-20+0．6％甘露醇；溶剂6组为PBS。2．2注药后24h、48h、1周、2周观察眼内炎症反应情况、玻璃体及视网膜情况。2．3注药后2h、4h、8h、24h分别检测其眼压变化情况。2．4注药后2周行视网膜电图(ERGs)检查，测最大混合反应，记录a波及b波振幅。2．5注药后20天摘除动物眼球，以多聚甲醛固定，包埋切片后常规HE染色，光学显微镜观察视网膜各层结构，并在高倍镜下随机选取5个视野对视网膜神经节细胞进行计数。2．6统计学软件分析每组注药前后及同期实验眼眼压、a波及b波振幅、视网膜神经节细胞计数的差异。3．结果3．1溶剂3、5组各1眼及溶剂6组2眼出现了较严重的炎症反应。溶剂4组中有1眼出现玻璃体混浊。3．2溶剂1组1眼、溶剂2组3眼、溶剂4组2眼、溶剂5组1眼、溶剂6组2眼出现不同程度的晶状体混浊。3．3溶剂1组和4组分别有1眼出现视网膜点状出血。3．4溶剂1组注射后2h与注射前相比眼压明显降低。溶剂4组注射后8h与注射前相比眼压明显升高。溶剂5组注射后2h、24h眼压明显降低。3．5溶剂1组及4组HE染色光镜观察，视网膜结构层次清晰，内、外核层水肿明显，神经节细胞层细胞明显减少。溶剂1、2、3、4、5组的神经节细胞层细胞计数均减少，与对照组的差异均有统计学意义(P＜0．05)。3．6根据上述结果分析，在本实验中，溶剂1刺激反应较轻，对眼压无明显影响，可疑晶状体毒性，但需排除操作因素，可疑视网膜毒性。溶剂2刺激反应较轻，可能一过性升高眼压，可疑晶状体毒性，未见明显视网膜毒性。溶剂3刺激反应较轻，对眼压无明显影响，未见明显晶状体、视网膜毒性。溶剂4刺激反应较轻，对眼压无明显影响，可疑晶状体毒性，可疑视网膜毒性。溶剂5刺激反应较重，可能降低眼压，可疑晶状体毒性，但需排除操作因素，未见明显视网膜毒性。溶剂6刺激反应较重，对眼压无明显影响，可疑晶状体毒性，未见明显视网膜毒性。4．结论在备选溶剂中溶剂3(PB+0．05％Tween-20)毒性作用最小，最适合作为KH902的溶剂。第2部分KH902制剂猴眼玻璃体腔注射的初步筛选试验1．目的国内外已有大量基础研究及临床试验证明抗VEGF制剂治疗CNV的有效性。目前国外已有治疗CNV的抗VEGF药物上市，而国内尚处于研究阶段。KH902是重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白注射液。本部分实验对比3种不同溶剂配制的KH902玻璃体腔注射液的安全性，以确定最佳的制剂方案。2．方法2．1 8只普通级恒河猴随机分为4组，玻璃体腔注射前进行眼压测量、眼前节、眼底及ERGs检查。对照组注射生理盐水，其余3组为KH902制剂1组注射KH902制剂1，KH902制剂2组注射KH902制剂2，KH902制剂3组注射KH902制剂3。2．2注药后24h、48h、72h观察眼内炎症反应、玻璃体及视网膜情况。2．3注药后0．5h、24h、48h分别检测其眼压变化情况。2．4注药后5天行视网膜电图(ERGs)检查，记录a波及b波振幅。2．5注药后20天处死动物，即刻摘除眼球，固定液固定眼球，包埋切片后常规HE染色，光学显微镜观察眼部结构。2．6统计学软件分析每组注药前后及同期实验眼眼压、a波及b波振幅。3．结果3．1 KH902制剂1组中2眼注射后第1天出现眼前房渗出物，阿托品眼膏点眼后前房渗出消失，注射后5天裂隙灯显微镜下可见有轻度玻璃体细胞(+～++)，KH902制剂3组中1眼注射后出现前房渗出，未予处理自愈。3．2眼底检查：各组动物注药后各时间点眼底未见异常。3．3注药后0．5h、24h及48h眼压与给药前比较，各组未见显著性差异。3．4 ERGs：KH902制剂1组可见给药后混合反应及视锥细胞振幅较给药前降低。对照组及其余两注射组注药前后ERGs无明显改变。3．5组织学检查KH902制剂1组和KH902制剂2组发现有前部葡萄膜炎(3眼)，KH902制剂2组发生视网膜神经纤维层血管周围炎(2眼)，KH902制剂2组有结膜慢性炎症(2眼)，KH902制剂3组眼球未见明显异常。结论KH902制剂1组和KH902制剂2组发现有轻度眼内炎症的病理学改变。KH902制剂1组注药后ERGs混合反应及视锥细胞振幅较给药前降低，存在视网膜毒性作用。KH902制剂3组未观察到眼部异常改变。因此，相比之下，KH902制剂3更适合玻璃体腔注射给药方式。