论文部分内容阅读
背景:随着社会老年化的加重,心脏瓣膜疾病已成为一种危害人类健康的公共卫生问题,且发病率逐年上升。其中钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)在心脏瓣膜疾病中占据非常重要的地位。目前对于CAVD的治疗尚无有效的预防措施,也无有效药物治疗,心脏瓣膜置换是治疗CAVD最有效的方法,机械瓣膜和生物瓣膜是临床上经常使用到的人工心脏瓣膜置换物,然而它们都有一定的不足之处。患者植入机械瓣膜后可能会出现出血及血栓形成的并发症,手术之后需终生服用抗凝药物。生物瓣膜虽然具有良好的生物相容性,但是易发生瓣膜钙化、退行性变,致使患者10-15年后可能需要再次进行瓣膜置换手术。所以研制出一种和正常瓣膜相当的理想人工瓣膜一直都是心脏外科医生追求的目标。目的:本实验将骨保护素(OPG)通过迈克尔加成反应共价修饰到去细胞猪主动脉瓣上,并探索该反应发生的最佳反应条件,为组织工程心脏瓣膜支架材料的改性修饰提供新的思路。方法:首先在去细胞猪主动脉瓣上通过N-丁二酸-S-乙酰基巯基乙二醇酯(SATA)引入巯基基团,然后通过迈克尔加成反应将4臂聚乙二醇-丙烯酸酯(4-arm-PEGacrylate)接到去细胞瓣膜的胶原上,再将骨保护素(OPG)N端半胱氨酸残基与去细胞瓣膜上4-arm-PEG-acrylate中的丙烯酸酯共价结合,将OPG结合到去细胞瓣上,探索OPG在不同浓度的OPG溶液以及不同反应时间点条件下最佳结合条件。HE、VG染色和扫描电子显微镜评价去细胞和PEG化效果,通过免疫荧光实验确证OPG在去细胞瓣上的结合效果,细胞毒性实验测试OPG修饰的去细胞瓣膜对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的影响,力学性能测试实验检测OPG修饰的去细胞瓣膜的相关力学性能。结果:1.HE染色:结果显示正常猪主动脉瓣膜(PAV)瓣膜结构完整,有大量的细胞存在;去细胞猪主动脉瓣膜(DPAV)细胞外基质基本保存完整,未见细胞残余,纤维呈波浪状排列;PEG-DPAV镜下所见同DPAV组。2.VG染色:结果显示正常瓣膜组织中胶原纤维染成红色,排列整齐,有大量黑色细胞核存在,而DPAV和PEG-DPAV均未见残余细胞核,纤维保持完整。3.扫描电子显微镜观察:结果显示正常瓣膜表面见细胞覆盖,未见纤维明显裸露;DPAV和PEG-DPAV表面均未见残余细胞,但PEG-DPAV较DPAV纤维结构更加致密。4.经OPG修饰PEG-DPAV(OPG-PEG-DPAV)条件的探索:实验从OPG结合效率以及经济效益角度得出,每片瓣膜(1cm×1cm)与1ml浓度为500ng/ml OPG反应2h,能使OPG结合效果达到最佳。5.免疫荧光实验:结果显示OPG-PEG-DPAV上有大量的OPG修饰的荧光,而PEG-DPAV未见任何荧光,从而证实OPG成功结合到去细胞瓣上。6.细胞毒性实验:结果表明OPG-PEG-DPAV无细胞毒性,OPG-PEG-DPAV的细胞增值率在24、48h分别为(103.05±3.24)%和(106.83±6.17)%。7.力学性能实验:在径向和圆周方向上,OPG-PEG-DPAV的力学性能与正常瓣膜相当。结论:1.组织形态学结果表明去细胞效果良好,未见细胞残留,瓣膜纤维结构完整,且经PEG交联后的纤维结构更加致密。2.成功制备出经OPG修饰的去细胞猪主动脉瓣膜,并得出OPG结合效果最佳化的条件,且OPG-PEG-DPAV无细胞毒性,力学性能和正常猪主动脉瓣膜相当。3.本研究为体外组织工程心脏瓣膜支架材料的改性修饰提供一定依据,为构建组织工程抗钙化心脏瓣膜提供新的思路。