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研究背景在临床治疗过程中,自体脂肪组织移植有着广泛的应用,临床上用于软组织缺损的充填,慢性创面的修复等,但自体脂肪移植也存在着一些问题,如患者脂肪组织量不足,对于大面积烧伤病人,皮下脂肪几乎消耗殆尽,很难移植其自身脂肪用于促进烧伤创面愈合及改善瘢痕。对于半面萎缩的病人,需要多次大量的脂肪移植充填,常常存在脂肪量不足的情况,只能要求患者增肥,然而一部分女性患者无法接受这种要求,而且如果患者存在术后减肥的情况,移植到面部的脂肪体积也会减少。同时自体脂肪抽吸时的疼痛及创伤,手术时间较长对于一些患者也是不愿接受的。基于自体脂肪移植存在的一些困难和弊端,异体脂肪移植技术开始进入人们的视野,得到了一些医生的关注。很多患者希望脂肪移植能够像透明质酸注射一样方便,但是许多学者反对异体脂肪移植技术,因为异体脂肪会导致免疫排斥反应或者传染疾病等,对于美容要求的求美者,当前应用自体脂肪移植无疑是最好的,但是对于一些疾病的治疗,如果能够创造条件应用患者近亲属的脂肪进行移植治疗,无疑增加了一种可选择的治疗方法。一些学者近几年已经在深入地研究异体脂肪的免疫环境及宿主-移植物病理生理学的效应。本研究的目的系在动物模型中初步探讨自体及异体脂肪移植免疫反应的对比并分析是否可通过辅助药物的应用而提高异体脂肪移植物的存活率。研究目的本研究目的是通过动物实验来探究自体脂肪与异体脂肪移植后产生的免疫排斥反应以及对自体及异体脂肪在移植后的存活率和生长形态的差异进行了分析并研究辅助药物是否可以优化异体脂肪移植物的存活率及效果。本实验设计分为三个部分:1.通过建立一个“兔耳模型”研究注射未处理的自体及异体脂肪移植的差异性的比较,研究自体脂肪与异体脂肪移植后产生的免疫排斥反应以及出现的不良反应,并且对自体及异体脂肪在移植后的存活率和生长形态的差异上进行分析。2.通过无免疫源性“裸鼠模型”研究不同辅助药物处理方式异体脂肪移植存活率,探索异体脂肪组织混合何种辅助药物能够取得更好的存活率。3.基于无免役源性裸鼠模型的结论,通过有免疫源性“兔耳模型”研究直接注射未处理的异体脂肪组织及与辅助药物(肉毒素、前列腺素注射液、PDRN)处理过的异体脂肪组织的存活及生长率。材料与方法1.“兔耳模型”未处理自体及异体脂肪注射对比:通过对14只新西兰大白兔进行自体脂肪移植与异体脂肪移植差异性的比较,采集不同时间点实验对象的血清及组织样本,进行大体观察,组织学观察,游标卡尺测量,微血管密度分析,苏木精-伊红染色(HE)染色、免疫组)及酶联免疫吸附试验(ELISA)分析,研究自体脂肪与异体脂肪移植后产生的免疫排斥反应以及出现的不良状况,并且对自体及异体脂肪在移植后,存活率和生长形态的差异上做了统计学分析。为了明确异体脂肪,最后使用的脂肪是来自于日本白兔腹股沟采取的脂肪组织。2.“裸鼠模型”不同处理方式(应用不用辅助药物预处理)异体脂肪移植存活率:用于异体脂肪组织移植的动物为SPF级裸鼠(出生周裸鼠,80只,体重20克左右)。从临床上获得人腹部来源的脂肪组织,在其游离脂肪颗粒中加入不同浓度梯度的肉毒素、雌激素、前列腺素注射液、胎盘、PDRN,将混合了药物的游离脂肪组织移植到裸鼠。同时,另设的硝酸甘油组、阿司匹林组则是在将游离脂肪颗粒移植到裸鼠后进行定期的涂抹及喂药。手术后进行常规定期的随访。术后3个月对8组脂肪组织(肉毒素、雌激素、前列腺素注射液、胎盘、PDRN、硝酸甘油及阿司匹林)分别取材,宏观上肉眼大体观察移植脂肪细胞存活情况,评估存活脂肪组织的称重和体积,行HE染色及应用CD31血管内皮细胞免疫组化染色进行新生血管计数,综合判定肉毒素、雌激素、前列腺素注射液、胎盘、PDRN、硝酸甘油及阿司匹林对于是否能提高脂肪细胞存活率进行分析。移植脂肪组织成活率和吸收率统计学分析。3.兔耳模型添加药物辅助的异体脂肪移植:建立兔耳动物模型的方法,将获取后的脂肪组织中加入不同浓度梯度的肉毒素、前列腺素注射液、PDRN,将混合了辅助药物的脂肪组织移植到兔耳。在手术后第7天,14天,38天,42天及56天,进行穿刺取材后,宏观上肉眼大体观察移植脂肪细胞存活情况,评估存活脂肪组织的湿重和体积,进行HE染色及应用CD31血管内皮细胞免疫组化进行新生血管计数,综合判定肉毒素、前列腺素注射液、PDRN对于是否能提高脂肪细胞存活率进行分析。结果1.兔耳自体及异体脂肪移植后取脂肪组织,进行HE染色观察,脂肪圆润光滑,个别样本略有结缔组织,表面分布的血管较为均匀,自体和异体脂肪细胞整个形态也均完整饱满。自体脂肪移植效果的统计学分析:术后3个月自体脂肪移植组与异体脂肪移植组比较,自体脂肪移植组和异体脂肪组脂肪成活率相近,显著性检验P>0.05。微血管密度分析:脂肪组织移植后,自体组的微血管密度最高为(43.80±11.69),异体组的微血管密度最高为(35.90±9.88)两者显著性检验P>0.05。不同组别的兔血清进行ELISA检测,结果显示:在手术完成初期,自体脂肪移植组与异体脂肪移植组的免疫反应都较为严重。待受体度过了危险期后,自体脂肪移植组与异体脂肪移植组的炎症因子的表达量都趋于稳定,相差无几。2.不同处理方式异体脂肪移植存活率的结果示使用药物雌激素混合异体脂肪组,PDRN混合异体脂肪组的移植物Bulking value有明显提升,移植物的形态上达到了更优异的效果。其他组(肉毒素、雌激素、前列腺素注射液、胎盘、PDRN、硝酸甘油及阿司匹林)平均水平也显著优于对照组。不同辅助药物混合异体脂肪注射后的肉毒素、雌激素、前列腺素注射液、胎盘、PDRN组均明显高于对照组(p<0.01),并且用药组各组间也比较有明显差异,其中PDRN在促进游离移植脂肪组织存活率最高,其余用药组别也显著高于生理盐水对照组,但其他脂肪组织移植组(肉毒素、雌激素、前列腺素注射液、胎盘、阿司匹林、硝酸甘油)的存活率与PDRN组比较略有降低。对移植物进行CD31免疫组化后进行微血管密度计数,高倍镜下同时发现用药组在不用程度上增加脂肪组织内血管密度,同时也促进新生血管的形成,尤其是D/F/G组棕色阳性血管的数目均显著高于其他用药组(p<0.05),并且两两组之间相互比较均具有统计学差异。3.从脂肪移植后的移植物的体积测量表明:肉毒素组、前列腺素注射液组、PDRN组均明显高于对照组(p<0.001),并且各组间比较有明显差异,这表明肉毒素、前列腺素注射液、PDRN三种辅助药物提高了移植物的存活率。且PDRN组的在脂肪的存活率方面有最优的表现。对脂肪移植后的移植物进行组织学HE染色后观察移植脂肪细胞存活情况并进行评分PDRN组的脂肪组织完整性明显高于肉毒素组及前列腺注射液组,炎性细胞浸润及纤维结缔组织增生程度明显低于肉毒素组及前列腺注射液组(p<0.001)。肉毒素、前列腺素注射液、PDRN三种辅助药物能显著促进游离脂肪组织的存活率,大大降低脂肪组织的纤维化率,同时发现脂肪组织内血管密度明显增加,明显促进新生血管的形成。对脂肪移植后的移植物进行CD31免疫组化染色后进行微血管密度计数,结果显示:移植的脂肪组织主要由纤维组织和微囊构成,纤维间隔分明,可见大量血管,呈岛状散布的脂肪细胞大小不规则,前脂肪细胞混合脂肪细胞大量存在。高倍镜下PDRN组棕色阳性血管的数目均显著高于肉毒素组及前列腺注射液组(p<0.001),并且两两组之间相互比较均具有统计学差异。对不同组别的兔子血清进行ELISA检测,结果显示:在移植早期兔子身上,雌激素混合脂肪注射组、PDRN混合脂肪注射和前列腺素注射液组引发的炎性变化存在着一定差异。结论通过实验论证,自体脂肪移植与异体脂肪移植在免疫排斥和存活率方面进行比较,自体脂肪移植与异体脂肪移植在免疫排斥相近的条件下,异体脂肪移植的脂肪存活率略低,但是从另一个角度来考虑,证明了异体脂肪移植是可以操作的。论证了可辅助异体脂肪组织注射的有效药物(PDRN),证明了一种潜在软组织混合充填生物材料,PDRN作为辅助药物能够和脂肪组织共同发挥协同作用,PDRN可促进异体脂肪组织的血管化及生长,有效的降低了异体脂肪移植后脂肪组织的吸收率,改善脂肪填充效果。这种新型的辅助药物混合脂肪共同使用的做法可以为现有的异体脂肪移植技术提供更为广阔的应用前景,为解决临床临床异体脂肪移植问题提供了实验依据。