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树木维管组织的次生生长是木材形成的基础。维管形成层细胞具有干细胞活性,通过向两侧不断地分裂分化,分别产生位于内侧的次生木质部和位于外侧的次生韧皮部,最终形成完整的次生维管组织。其中木质部细胞具有丰富的次生细胞壁,富含木质素,纤维素和半纤维素,主要负责为植物提供支撑,以及从根系向上的水分运输;而韧皮部则起着运输光合同化物以及信号分子的重要作用。韧皮部已被证明其分化与发育受到转录因子和植物激素的调控。其中APL转录因子已被报道具有促进拟南芥韧皮部分化和抑制木质部分化的双重作用;LBD1转录因子促进杨树次生韧皮部发育。细胞分裂素也被报道通过影响维管形成层细胞分裂从而在维管组织发育过程中发挥关键调控作用。已有研究表明,杨树茎中的细胞分裂素主要累积在次生韧皮部,并调控杨树剥皮后的韧皮部再生过程。然而,细胞分裂素、LBD1s和APLs三者调控次生韧皮部发育的相互关系及分子机制尚不明确,亟待进一步研究。杨树（Populus spp.）是全球重要的速生林树种,随着其全基因组测序完成,作为模式树种被广泛应用于林木分子生物学研究。本论文以毛白杨（Populus tomentosa）为研究材料,分析了细胞分裂素信号、LBD1s和APLs在杨树茎次生维管组织中的分布模式及对次生韧皮部发育的调控功能,利用体外次生维管组织再生系统验证了三者对次生韧皮部再生的重要作用,并进一步阐明了三者调控次生韧皮部发育的互作关系及相关分子机制。主要研究结果如下:1.精确表征细胞分裂素信号、LBD1s和APLs在杨树茎次生维管组织的分布模式为研究细胞分裂素信号的组织特异性分布模式以及LBD1s和APLs的转录位置,首先利用冷冻组织微切片方法,分别收集杨树茎的次生韧皮部、维管形成层和次生木质部组织,并通过q PCR检测次生维管组织中A型RR基因的表达量（A型RR基因能够直接响应细胞分裂素信号,因此被作为衡量内源细胞分裂素信号水平的标记基因）,发现A型RR基因主要表达在次生韧皮部。同时构建了由A型RR基因启动子驱动的YFP荧光报告株系,通过共聚焦荧光显微镜检测到茎横切片中的荧光信号主要在次生韧皮部,从而证实了细胞分裂素信号主要分布在次生韧皮部。其次通过构建LBD1s和APLs启动子驱动的GUS报告株系,发现LBD1s和APLs均主要表达在次生韧皮部。因此,细胞分裂素信号、LBD1s和APLs均主要定位于杨树茎的次生韧皮部,并且在空间位置上呈现出高度重叠。2.细胞分裂素信号、LBD1s和APLs影响次生韧皮部发育为探究细胞分裂素信号、LBD1s和APLs对次生韧皮部发育的调控作用,建立了由韧皮部特异性启动子介导的RNA干扰细胞分裂素信号受体和超表达细胞分裂素信号响应因子的转基因株系,同时也构建了基于CRISPR/Cas9技术敲除LBD1s和APLs的转基因株系。通过对阳性植株茎横切片进行甲苯胺蓝染色,统计次生韧皮部的相关表型并与野生型作比较,发现细胞分裂素信号、LBD1s和APLs均正向调控次生韧皮部发育。3.LBD1s和APLs敲除株系的韧皮部再生速率比野生型慢为深入探究细胞分裂素信号、LBD1s和APLs对次生韧皮部再生的影响,参考杨树体外茎次生维管组织再生系统,通过外源施加细胞分裂素处理剥皮（去掉形成层和韧皮部）的野生型、LBD1s和APLs敲除株系,观察韧皮部再生情况。通过对9DAG（days after girdling）的野生型、LBD1s和APLs敲除株系茎纵切片苯胺蓝染色观察,发现野生型出现绿色荧光的胼胝质,表明已再生出韧皮部,而LBD1s和APLs敲除株系并未出现再生的韧皮部。这表明LBD1s和APLs可能是韧皮部再生的关键转录因子,并且可能位于细胞分裂素信号下游调控次生韧皮部发育。4.细胞分裂素信号对次生韧皮部发育的调控依赖于LBD1s或APLs为了进一步验证细胞分裂素信号、LBD1s和APLs的调控关系,在特异性干扰韧皮部细胞分裂素信号的转基因株系背景下转入各自自身启动子驱动的LBD1s或APLs表达载体,通过对阳性植株茎横切片的甲苯胺蓝染色,发现原位过表达LBD1s或APLs能够恢复细胞分裂素信号下调造成的次生韧皮部发育缺陷。这些结果表明,LBD1s和APLs均位于细胞分裂素信号下游调控次生韧皮部发育。5.细胞分裂素信号直接诱导LBD1s基因表达,但不能激活APLs基因转录为了验证细胞分裂素信号与下游LBD1s和APLs是否存在直接调控关系,在特异性改变韧皮部细胞分裂素信号的转基因株系和外施细胞分裂素处理条件下,定量检测LBD1s和APLs基因的表达水平。结果显示,LBD1s基因响应于细胞分裂素信号的变化,而APLs基因不受细胞分裂素信号的调控。同时构建细胞分裂素响应因子B型RR13的过表达载体和LBD1s、APLs基因的启动子驱动的GUS报告载体,通过效应子报告系统（Effector-Reporter）确定细胞分裂素信号能够激活LBD1s基因的转录,但不能诱导APLs基因的表达。6.细胞分裂素响应转录因子RR13直接结合LBD1s基因的启动子进而促进其转录为了进一步确定细胞分裂素信号直接调控LBD1s基因转录,通过染色质免疫共沉淀（Ch IP-q PCR）分析发现LBD1s基因的启动子上有细胞分裂素信号B型RR响应因子的结合位点,进而将结合位点突变之后利用双荧光素酶效应子报告系统（Luciferase）验证B型RR13转录因子不能激活LBD1s转录。这些结果表明,细胞分裂素信号通过关键转录因子RR13直接结合LBD1s启动子并促进其转录。7.细胞分裂素信号依赖APLs与LBD1s异源二聚体调控次生韧皮部发育由于APLs位于细胞分裂素信号下游但并不受细胞分裂素信号诱导,我们猜测LBD1s与APLs在蛋白水平层面是否发生相互作用。为了验证该假设,通过双分子荧光互补实验（Bi FC）和免疫共沉淀（Co IP）,证明LBD1s和APLs蛋白能够发生直接互作。以上结果表明,APLs与LBD1s可能形成异源二聚体从而介导细胞分裂素对次生韧皮部发育的调控。综上所述,细胞分裂素信号、LBD1s和APLs均调控次生韧皮部发育,并且细胞分裂素信号直接调控LBD1s转录进而影响次生韧皮部发育,而APLs蛋白通过与LBD1s蛋白互作调控次生韧皮部发育。因此,细胞分裂素信号通过LBD1s与APLs蛋白互作模块调控杨树次生韧皮部发育。