过继免疫治疗，即给患者输注抗肿瘤免疫效应细胞的方法，是治疗恶性黑素瘤(malignant melanoma，MM)的一种重要的免疫策略。研究证实，MM对LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞)、TIL细胞(肿瘤浸润淋巴细胞)、CD3AK(抗CD3单抗激活的杀伤细胞)、PAK(PHA激活的杀伤细胞)、NK细胞等免疫细胞疗法均有一定的反应性。但由于激活效应细胞方法、种类单一；特异性和活性不高、持续作用时间短暂，因此整体疗效不尽人意。最新研究表明，经肿瘤疫苗刺激后的肿瘤过滤淋巴结(tumor-draining lymph node，TDLN)来源的T细胞，用CD3+CD28+IL-2体外刺激后重新置入体内，具有更强的抗肿瘤作用。美国密西根大学的研究小组应用TDLN细胞联合CD3+CD28+IL-2体外刺激方案，治疗晚期黑素瘤和肾癌，动物与临床实验均取得了明显疗效。 超抗原SEA(staphylococcal enterotoxin A)是金黄色葡萄球菌肠毒素，它能以完整的蛋白质分子形式分别直接与APC膜上MHCⅡ类分子抗原结合槽外侧及T细胞表面抗原识别受体TCRV β区相结合，不需要抗原提呈细胞 第四军医大学博士学位论文 （APC）处理，即可激活比普通抗原多达数千乃至数万倍的T淋巴细胞，是 一种强大的 T细胞激活剂。树突状细胞 DCUendritic cell）作为体内最重要 的抗原提呈细胞，由于细胞表面高表达T细胞活化所需的多种免疫分子，能 够有效递呈抗原和高效激活T细胞。鉴于SEA和DC在活化T细胞及抗肿瘤 免疫方面的独特作用，我们用 SEA基因修饰的 BI6细胞免疫的小鼠淋巴结 T 细胞（p LN人 在CD3＋CD28＋IL上方案基础上增加经B16细胞裂解物冲击 的DC细胞，体外联合刺激，以期寻找更加优化的诱导特异、高效杀伤MM 肿瘤细胞的方案，探索更加有效的治疗黑素瘤的免疫治疗途径。 我们构建了 pCDNA3．lSEA真核表达载体，应用脂质体介导转染 BI6 ’J’ 鼠黑素瘤细胞，G4加压筛选，得到阳性克隆后扩大培养，经 RT．PCR鉴定 转染成功。将BALB／c小鼠分成实验组和对照组，分别经小鼠尾静脉注射转染 与未转染的B16细胞，两周后观察小鼠肿瘤肺转移灶的个数，结果显示：与 对照组相比，S趴实验组小鼠肺部转移灶明显减少，差异显著中刃．01），证 明 SEA能够提高 BI6细胞的免疫原性，有效激发小鼠体内针对 BI6细胞 T细 胞的杀伤活性及抗黑素瘤的免疫反应。 本实验予高剂量Q00mg／kg体重）环磷酚胺（CY）经尾静脉注射小 鼠，8天后可见小鼠脾脏显著增大，此脾细胞经 GM（SFQ）＋n斗 （lug／u）培养，第5天补加细胞因子M Y＊ ＊ 吕天后，获得大量淋 巴系 DC细胞，即 CYSPDC，每只小鼠平均可得 7．5 X”细胞。培养后的细胞 经相差显微镜、扫描电镜及透射电镜观察，均具有典型的DC形态特征。同 时，应用流式细胞仪分析细胞的表型，结果显示 N418（CD 11。）MHCll （lab）；MHC－1类（H ZDb＼B7上比D86）等成熟DC细胞表面的主要免疫 标记分子随时间变化总体呈现上升趋势，到第7天时，B7．2（CD86）高达到 80．59％。以上证实我们已在体外培养出具有免疫活性的成熟的DC细胞。 我们用 SEA基因修饰的与未经任何修饰的 BI6细胞分别免疫 BALB／c小 ·4· 第四军医大学博士学位论文 鼠的两侧腹股沟淋巴结；以 BI6细胞抗原裂解物冲击体外培养的成熟 DC；第 9天取出淋巴结细胞，以DC＋rln－2＋mCD3＋ffiCD28及mCD3＋mCD28＋rIL－2为 刺激条件培养，3天后进行体外相关免疫学功能检测。实验结果显示，经SEA 免疫和 DC＋CD3＋CD28＋n－2联合诱导的 T细胞MTh增殖指数为 63％士 0．03；h．T妞杀伤活性为87．6％、sl．30、76．5O（效靶比40：120：110： 1）；流式细胞仪检测的CD4、CDS、IN’F．Y表型为60。01％、38．46％、 88．70％，均高于其它实验组中刃．01人而IL10最低，5．叮％；另外，在B16 细胞免疫，联合DC＋rILZ＋mCD3＋mCD28刺激的T细胞实验组也显示了仅次 于上组但明显高于别组的体外增殖和杀伤活性。建立黑素瘤小鼠肺转移模 型，将体外刺激的T细胞经尾静脉回输小鼠体内，观察对小鼠体内肿瘤生长 的抑制作用，实验结果显示：经SEA免疫和DC＋rIL．2＋mCD3＋mCD28联合 诱导的T细胞抑瘤率为87．2％，明显高于其它实验组，具有较强的体内杀伤 肿瘤细胞的活性。 我们的上述研究表明，经 BI6－SEA肿瘤疫苗刺激后的 TDLN来源的 T 细胞，体外经DC＋CD3＋CD28＋IL．2方案刺激，可以诱导出较单纯CD3＋CD28 ＋o．2刺激更高效、特异的针对黑素瘤的T淋巴细胞，在体内外具有较强的抑 制和杀伤肿瘤细胞的能力。这种诱导T细胞?