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高脂血症是一种由于机体脂类代谢异常而导致的慢性疾病,近些年,死于由高血脂直接或间接引发的相关疾病的人数逐年上升,临床表明益生菌的摄入有助于降低血脂水平,维持机体血脂指标的平衡,同时无副作用的特性使得益生菌成为降血脂类药物替代品的研究热点。因此基于人源肠道微生态,筛选出具有降胆固醇效应的益生菌,比较益生菌不同干预频次及周期对高脂血症大鼠相关生理生化指标的影响,具有一定的研究价值,也是利用益生菌研究开发降血脂类产品的关键。本研究从广西巴马长寿人群肠道中分离出来的益生菌菌株中筛选出具有较好体外降胆固醇效应的菌株,并将其用于高脂血症大鼠模型中,研究益生菌干预频次及周期对高脂血症大鼠肝脏生理生化、抗氧化功能、降血脂、粪便短链脂肪酸含量以及肠道菌群的影响,以提高益生菌利用率,也可为益生菌的临床治疗定量提供理论依据。1、具有降胆固醇效应菌株的体外筛选从40株实验室保藏的人源乳酸菌中筛选出具有降胆固醇作用的乳酸菌作为目标菌株进行后续动物实验。结果表明:40株乳酸菌中,主成分分析综合得分最高的为Lactobacillus.plantarum 67及Lactobacillus.fermentum 83,这两株菌株在人工胃液中的存活率为233.33%和50.88%,在人工肠液中的存活率为345.00%和76.00%,在0.3%的胆盐培养基中的存活率为26.60%和27.08%,TC降解率为3.67%和0.88%,TG降解率为12.55%和3.24%,羟自由基清除率为85.01%和84.40%,DPPH自由基清除率为93.66%和94.29%,还原力为2.04和2.19,表面疏水性为89.94%和36.35%,自聚合能力为85.27%和37.48%,综合得分为2.29和0.82,且都能产胆盐水解酶。2、构建高脂血症大鼠模型并进行动物实验购买126只Wistar雄性大鼠分为空白对照组(NC)和模型组,连续饲喂高脂饲料4w后,模型组大鼠与NC组相比,血清中TC、TG和LDL-C水平显著上升(p<0.05),HDL-C水平显著下降(p<0.05),说明高脂血症大鼠模型构建成功。造模成功后将模型组分为高脂模型组(MC)、L.plantarum 67菌株一周连续干预7次的6L组、一周干预5次的65组、隔1日干预1次的6G组、L.plantarum67和L.fermentum 83菌株1:1混合的菌悬液一周连续干预7次的HL组、一周干预5次的H5组和隔1日干预1次的HG组,空白组每日饲喂普通饲料,按体重灌胃生理盐水(1mL/100g),高脂模型组每日饲喂高脂饲料,按体重灌胃生理盐水(1mL/100g),益生菌干预组每日饲喂高脂饲料,按体重按不同组别灌胃不同益生菌菌悬液(108CFU/mL,1mL/100g)。分别在灌胃4w、6w和8w后禁食禁水12h,早上称重,脱臼处死,取相关样品组织测定指标。3、间歇性益生菌干预对高脂血症大鼠肝脏生理生化的影响测定血清中的肝功能三项指标(ALT、ALB和TP),计算大鼠的肝脏指数并且观察肝脏的HE染色切片。结果表明:益生菌干预后,与MC组相比,大鼠体重增长受到控制,肝脏指数显著下降(p<0.05),ALT指标显著下降(p<0.05),在干预6w-8w期间,ALB和TP指标显著上升(p<0.05),肝脏切片显示,益生菌干预后可见完整肝细胞,细胞间脂滴变少,但仍可见少量大脂滴,因此本文筛选出的具有较好体外降胆固醇效应的菌株L plantarum 67一周干预5次能有效控制高脂血症大鼠体重,改善肝脏指数和血清肝功能三项指标情况,可有效恢复肝脏细胞形态,且对体重、肝脏指数和ALT指标的干预效果与干预时间成正比,对ALB和TP指标的干预效果与干预时间不成正比;研究同时利用混合菌株采取相同的灌胃频次进行验证,得到相同结论。4、间歇性益生菌干预对高脂血症大鼠血清脂质过氧化的影响测定大鼠血清中抗氧化五项指标(GSH-Px、T-SOD、CAT、MDA、T-AOC)、血清中的血脂四项指标(TC、TG、HDL-C、LDL-C)并计算动脉粥样硬化指标AI。结果表明:益生菌干预后,与MC组相比,大鼠血清中GSH-Px、T-SOD、CAT、MDA水平显著下降(p<0.05),T-AOC能力显著上升(p<0.05),各干预组TC、TG、LDL-C和AI值显著下降(p<0.05),HDL-C水平显著上升(p<0.05),且对抗氧化指标和血清血脂四项以及AI值干预效果最好的是65组,因此,L.plantarum 67一周干预5次能有效改善高脂血症大鼠的抗氧化能力,能有效降低血脂指标,且对TC和LDL-C指标的干预时间越长,干预效果越明显,对TG、LDL-C以及AI指标的改善效果与干预时间不成正比;由混合菌株干预验证实验可知,一周干预5次能有效提高大鼠抗氧化能力,降低血脂指标,且对MDA、T-AOC、TC和LDL-C指标的干预存在时间依赖性,对TG、LDL-C以及AI指标的改善效果与干预时间不成正比,以上结果与单菌组结果一致,对GSH-Px、T-SOD、CAT水平的干预效果与干预时间不成正比的结论与单菌实验组不同,但单菌组的三项指标水平显著高于混菌组(p<0.05)。5、间歇性益生菌干预对高脂血症大鼠粪便短链脂肪酸和肠道菌群的影响取保存在-80℃冰箱中的新鲜粪便,测定粪便中的SCFAs含量和大鼠肠道菌群,分析在门、属分类水平上的结构变化以及肠道菌群物种丰度情况。结果可得:与MC组相比,益生菌干预全过程中乙酸含量显著下降(p<0.05)、异丁酸含量有不同程度下降,益生菌干预6w-8w期间,丙酸、丁酸含量显著上升(p<0.05),异戊酸含量显著下降(p<0.05),益生菌干预8w时,戊酸含量显著上升(p<0.05),对大鼠粪便SCFAs含量干预效果最好的是6L组,因此L.plantarum 67一周连续干预7次能有效改善高脂血症大鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸六种SCFAs水平,且对丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸含量的干预效果与干预时间成正比,对乙酸和丙酸含量的干预效果与干预时间不成正比。由混菌验证实验可知,一周干预7次确能改善大鼠粪便中SCFAs含量,对于乙酸和丙酸的干预效果与干预时间不成正比的结论与单菌一致,对于其余四种SCFAs的干预效果与干预时间不成正比的结论与单菌不一致,但指标水平与单菌组无显著性差异(p>0.05)。与MC组相比,干预8w后,益生菌干预组厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门以及放线菌门相对丰度显著下降(p<0.05),螺旋体门相对丰度显著上升(p<0.05),三组干预组各项门相对丰度之间均有显著性差异(p<0.05);与MC组相比,各干预组的苏黎世杆菌属相对丰度显著下降(p<0.05),各干预组的乳杆菌属、罗斯氏菌属和密螺旋体菌属相对丰度显著上升(p<0.05),三组干预组各项菌属水平之间均有显著性差异(p<0.05);三组干预组中,6L组丰度大的OUT数最多,Shannon指数最高,说明经益生菌干预可改善高脂血症大鼠肠道菌群的物种多样性和丰富度,且以一周干预7次的效果最佳。