脓毒症是患者异常生理变化表现综合征。脓毒症的最大挑战之一的是对其发生发展的潜在病理生理机制的更详细的了解。大量的研究已经发现内皮细胞活化和脓毒症间的联系,而且日益显现出,内皮细胞在脓毒症起着关键作用。脓毒症中内皮细胞激活的变化包括凝血功能、白细胞趋化粘附、血管通透性的变化,与炎症发生发展以及和微循环障碍息息相关。尽管这些变化是宿主对感染的正常反应的一部分,但在脓毒症中它们可能过度表达从而成为脓毒症异常的表型的标志。相关研究表明,循环内皮生物标志物的水平增加证明人类脓毒症与内皮细胞的活化相关。这些生物标记物和脓毒症病情的严重程度和器官功能障碍之间的存在关联。基于内皮细胞在脓毒症病理生理学中的核心作用,这些发现不仅可以提高我们在脓毒症病理生理过程中的内皮细胞部分的理解,但也可能会提示建议相应目标诊断指标和特定的治疗性干预的可能。新近的mi RNA-23b给我们提供了观察脓毒症内皮细胞变化发生和发展的新途径。本文包括两部分:第一部分micro RNA-23b调节脓毒症脐静脉血管内皮细胞炎症因子的表达Mir-23b是新近发现的mi R,可以调节多种的信号通路,在细胞的增殖、细胞的分化、细胞的凋亡、以及细胞黏附等方面均能发挥作用,并在数种肿瘤中呈现低表达,被认为是类似于癌基因或抑癌基因从而发挥重要作用。据报道,mir-23b防止多种自身免疫性疾病通过调节炎症细胞因子的途径,它调节炎症因子如NF-κB,TNF-α,IL-1β和IL-17。因此,我们推测脓毒症中mir-23b可能通过NF-κB通路和IL-17,从而调节NF-κB介导的血管内皮细胞的活化。在这项研究中,通过细菌脂多糖(LPS)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs),然后转染mir-23b的模仿剂或者抑制剂进入细胞,并观察转染对mir-23b表达的上调和抑制作用,对脓毒症血管内皮细胞表达的炎症调节因子的影响。进而探讨mir-23b作为脓毒症的靶点以及生物标志物的可能性。方法:mir-23b抑制剂和模拟剂分别被转染到人血管内皮细胞(HUVEC)从而分别抑制和上调mir-23b表达。抑制剂和模拟剂的阴性对照(NC)同样进行转染以便对照。观察LPS刺激后4h和8h后各组细胞NF-κB、TNF-α、IL-6、E选择素、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达和m RNA的表达,以及mi R-23b表达的荧光图片,进行分析和比较。组间行χ2检验或t检验,SPSS16.0统计软件进行统计分析,P<0.05为有显著差异。结果:1转染mir-23b抑制剂抑制了人脐静脉的内皮细胞中的mir-23b的表达;转染模拟剂则可促进mir-23b的表达使用荧光显微镜可见人脐静脉的内皮细胞中,mir-23b发出绿色荧光。而定量PCR的结果则表明,mir-23b抑制剂的转染组与空白对照组及NC组相比较,其mir-23b的表达可见显著的降低,表明mir-23b抑制剂的转染抑制mir-23b的表达有效。与此相反,mir-23b模拟剂的转染组与空白组和NC组的模拟剂组相比,则发现mir-23b的表达增高,表明mir-23b模拟剂的转染可促进mir-23b表达。2 LPS下调人脐静脉的内皮细胞中mir-23b的表达LPS刺激的人脐静脉的内皮细胞模拟脓毒症中血管内皮细胞。结果显示,相比没有用LPS刺激细胞表达的mi R-23b,转染显著模拟剂对照和拮抗剂对照的细胞LPS刺激4h或8h后的mi R-23b表达明显下降(P<0.01)。结果表明,在LPS刺激导致人脐静脉的内皮细胞的mir-23b表达减少,在脓毒症中血管内皮细胞活化伴有mir-23b表达的抑制。相反,在模拟剂转染组与没有LPS刺激的细胞相比较,LPS刺激后4h、8h检测发现,mir-23b表达轻微下降,但仍处于高水平。在抑制剂的转染组中,LPS刺激后内皮细胞所表达的mir-23b则仍然很低。3 LPS促进炎性细胞因子表达的影响LPS刺激人脐静脉内皮细后4h、8h检测发现,炎性因子NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,VCAM-1和E-选择素E均显著增加(P<0.05),表明LPS刺激的人脐静脉的内皮细胞表达炎性细胞因子,进而导致脓毒症中的炎症反应。4 mir-23b模拟剂抑制LPS刺激后炎症因子的表达LPS刺激人脐静脉的内皮细胞4h、8h在转染模拟NC组的NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,VCAM-1和E-选择素m RNA表达明显增加(P<0.05),与转染模拟剂组有明显差异(P<0.05)。Western blot分析结果表明,LPS刺激后4h检测发现,模拟剂转染组的NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1和E-选择素的蛋白水平,明显低于模拟剂NC组4h(P<0.05)。LPS刺激后8h检测发现,VCAM-1的蛋白水平在模拟剂的转染组显著的低于模仿剂NC的转染组(P<0.05)。5 mir-23b抑制剂的转染对LPS刺激以后细胞的炎症因子的表达产生影响抑制剂NC转染组LPS刺激4h、8h后检测发现,其NF-κB,IL-6,ICAM-1,VCAM-1和选择素E的表达,比其刺激以前的水平有显著的增加(P<0.05)。这些炎性因子的表达水平在抑制剂转染组LPS刺激后与刺激前比较,也明显升高(P<0.05)。此外,抑制剂转染组与抑制剂NC转染组比较,LPS刺激后4h、8h后炎性因子水平显著升高。Western blot分析表明,与抑制剂NC转染组比较,LPS刺激后4h、8h抑制剂转染组细胞的NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,E选择素和VCAM-1蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。结论:LPS刺激后内皮细胞的mi R-23b表达下降,而转染mi R-23b模拟剂后,LPS刺激内皮细胞后NF-κB,IL-6,ICAM-1,VCAM-1,选择素E的表达下降,而转染mi R-23b抑制剂后,LPS刺激内皮细胞后NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1、选择素E的表达上调。以往研究表明,这些炎性因子均是脓毒症炎症网络系统(inflammatory network)的重要组成因子,在脓毒症的发生、发展过程中起关键作用。因而我们认为,mi R-23b可以通过抑制血管内皮细胞炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-6、E选择素、ICAM-1、VCAM-1的释放,进而对脓毒症进行调节。第二部分micro RNA-23b在脓毒症患者外周血的表达收集样本外周血取自20例脓毒症患者、10例SIRS患者及10例正常对照组人群,记录相关的临床资料,并采用mir Vana PARIS Kit方法进行样本外周血的血清中RNA抽提,然后使用Allin One的mi RNA q RT-PCR法对mi RNA-23b在血清中的相对定量进行检测,同时测定血中WBC计数、血清TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值的变化,并结合患者的临床资料测定SOFA评分,比较脓毒症、SIRS及正常对照组血清中mi RNA-23b表达的差异,分析血清mi RNA-23b的表达与脓毒症患者SOFA评分、WBC计数、血清TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值的关系,并分析脓毒症死亡组与存活组之间的差异,从而判定其与临床指标及预后的相关性。结果1、mi R-23b的检测灵敏度以及线性范围mi R-23b和U6检测的最低检出界限为6.97 pg/μL RNA,在6.97~6.97×104pg/μL的RNA范围内mi R-23b和U6测定的Ct值与RNA浓度之间存在良好的线性相关关系(r>0.999)。2、外周血中mi R-23b的温度稳定性在4℃保存外周血循环血,1、3及5 d后,其总定量RNA从51.32 ng/μL下降至18.3 ng/μL,由此可见总RNA的降解随保存时间的延长同步增多。而外周循环血的白细胞中mi R-23b和U6的表达水平则没有明显变化。3、脓毒症患者病情分析20例脓毒症患者中病情分布为:心内膜炎患者2例,胆道感染患者2例,腹膜炎患者4例,肺部感染患者12例。28 d病死率为20%(4/20);SOFA评分2~11分,平均(5.8±2.52)分。4、外周血中mi R-23b、WBC、血清中TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α的比值变化与对照组相比较,脓毒症组对象的mi R-23b表达显著降低(P<0.01),同时其血液中的WBC、IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值均显著升高(P<0.01);而脓毒症组与SIRS组之间比较,各项指标均没有统计学差异(P>0.05)。5、预后不同,脓毒症病患组内mi R-23b、血清中IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值之间的差异脓毒症患者组中死亡患者与存活患者相比较,mi R-23b表达量明显降低(P=0.003,P<0.01),而血清中IL-10的水平则明显升高(P=0.037,P<0.01)。两组患者的组间白细胞数(P=0.584),血清中TNF-α水平(P=0.324)以及IL-10和TNF-α的比值(P=0.263)均没有显著的统计学差异(P>0.05)。6、脓毒症患者的mi R-23b水平与其自身的WBC、血清中TNF-α、IL-10的水平以及SOFA评分之间的关系脓毒症患者外周血mi R-23b表达所需的循环数与其自身的SOFA评分、血清中的TNF-α和IL-10呈显著相关(其r值分别为0.473、0.485和0.470,P<0.05);其与WBC计数(r值分别为0.301)以及IL-10和TNF-α的比值均无明显相关(r值为0.039,P>0.05)。7、IL-10、TNF-α在脓毒症组病患的表达水平及两者的比值和SOFA评分之间的关系脓毒症患者的SOFA评分与血清中的IL-10(r值为0.369)、TNF-α(r值为0.410)和IL-10与TNF-α的比值(r值分别为0.124)均无明显的相关性(P>0.05)。限制此研究有许多限制。首先,我们没有使用一个连续的患者人群因此这项研究可能会受到选择偏倚。其次,我们只分析了从最初循环血的相关指标,而并没有随着时间的推移动态观察相应生物标志物的变化。第三,有可能有未测量的干扰因素或混杂。第四,部分纳入脓毒症或SIRS组患者可能有其他疾病的原因,可能是误诊,而最终对其结果形成了干扰。最后,我们的样本规模太小。更大规模的研究可能提供更完整的分析。结论:mi RNA-23b的表达水平在脓毒症组患者较正常对照组明显下降,但与SIRS组患者相比较则无明显差异。mi RNA-23b的表达水平反应了机体的免疫水平,可能作为脓毒症的严重程度和判断预后的生物学分子标志物,而其能否能在脓毒症的临床辅助诊断以及预后判断中进行应用,则需要大样本量临床研究对其进一步判断,mi RNA-23b在脓毒症发生和发展中的相关作用以及机制,任然有待对其进行深入的研究。