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一、研究背景抑郁症是由于生物、心理和社会等多因素导致的,以情绪低落、思维迟缓和意志活动功能减退为主要表现的病症。抑郁症往往有着高复发率、高致残率以及致死率的特点,这给家庭和整个社会带来不良影响和沉重的负担。据世界卫生组织的最新报道,全球抑郁症患者约有3.22亿,抑郁症患病率高达4.4%,在我国抑郁症的发病率大约为4.2%。抑郁症的发病率高居精神类疾病之首,严重影响着患者的身体和心理健康。随着对抑郁症的研究不断深入,近年来细胞信号传到通路的研究在抑郁症的发病机制中被广泛研究探讨,并且在抗抑郁药治疗中的作用也受到了越来越多的重视。与抑郁症发病机制密切相关的信号传导通路——JNK信号通路,由胞外刺激激活机体JNK信号传导通路,JNK信号通路的激活可引起神经萎缩、炎性反应和细胞凋亡等。有大量研究表明,近年来运用JNK抑制剂或基因敲除等手段均证明抑郁症的症状调控与JNK有密切关系。同时一部分的抗抑郁药涉及对JNK的活性调节,这些已初步确立抑郁症与JNK信号通路之间的关系。抑郁症在中医中属郁证范畴,肝郁脾虚证是其常见的证候类型之一,因此基于ASK1-MKK4/7-JNK信号传导通路,可能作为肝郁脾虚证抑郁症发病机制的研究通路。二、研究目的本研究拟选择6周慢性不可预知温和刺激的动物肝郁脾虚模型,以行为学和ASK1-MKK4/7-JNK信号通路上与抑郁和应激密切相关的主要效应因子,以及细胞凋亡细胞caspase-9为主要观察指标,观察在肝郁脾虚证候模型中,ASK1-MKK4/7-JNK信号通路上关键效应分子的表达变化,以及基于ASK1-MKK4/7-JNK信号通路,逍遥散的抗抑郁作用的有效性。三、研究方法实验用清洁级健康雄性C57BL/6J小鼠60只,周龄:10～12周,体重:20±3g,动物饲养于SPF级的动物房内,适应性喂养7d,单笼饲养,随后按照随机分组法,将60只小鼠随机分为四组,分别为正常组、模型组、逍遥散组、氟西汀组,每组15只。饲养环境的条件要满足室温温度为(21 ±2)℃,相对湿度保持在30%-40%之间,喂养小鼠的饮用水为去离子水,每日光照时间和黑暗时间均为12h并且保持相对安静。本实验采用6周慢性不可预知温和刺激造模方法,有效复制肝郁脾虚型抑郁症小鼠模型。通过对小鼠的宏观表征、摄食量、体重和一系列行为学(包括糖水偏好实验、旷场实验等)对动物模型进行评价。对小鼠进行腹腔注射麻醉。麻醉后,冰上分离海马,基于ASK1-MKK4/7-JNK信号通路,western-blot和实时荧光定量PCR检测关键效应因子的蛋白含量和m RNA含量以及caspase-9的基因表达。四、实验结果本实验对模型小鼠进行体重、摄食和行为学测试,结果发现模型组小鼠的体重较正常组降低,摄食量也明显减少,模型组小鼠对糖水的偏好率降低,在旷场中移动总距离减少,这一系列结果表明实验成功复制了肝郁脾虚证小鼠模型,基于ASK1-MKK4/7-JNK信号通路,采用实时荧光定量PCR检测小鼠海马中ASK1、MKK4、MKK7、JNK的mRNA水平的变化结果。其中观察ASK1各组的表达量,与正常组相比,模型组的表达量上升,具有统计学差异(P<0.01);逍遥散组和氟西汀组的表达量明显低于模型组,具有统计学差异(P<0.05)。观察MKK4各组的表达量,与正常组相比,模型组的表达量上升,并且具有统计学差异(P<0.01);逍遥散组的表达量明显低于模型组,并且具有统计学差异(P<0.01),而氟西汀组的表达量虽有下降,但与模型组并没有出现统计学差异(P>0.05)。观察MKK7各组的表达量,与正常组相比,模型组的表达量上升,并且具有统计学差异(P<0.05);逍遥散组和氟西汀组的表达量与模型组相比均下降,并且具有统计学差异(P<0.01)。观察JNK各组的表达量,与正常组相比,模型组的表达量上升,并且具有统计学差异(P<0.05);逍遥散组和氟西汀组的表达量与模型组比较均有下降,并且具有统计学差异(P<0.05)。用实时荧光定量PCR方法检测小鼠海马中caspase-9的基因表达。与正常组相比,模型组的caspase-9基因表达明显上升并且具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,逍遥散组和氟西汀组的caspase-9基因表达明显下降并且具有统计学差异(P<0.05)。蛋白水平实验相关结果:基于ASK1-MKK4/7-JNK信号通路,用Western blot检测小鼠海马中ASK1、MKK4、MKK7、JNK、p-JNK的蛋白含量。与正常组相比,模型组小鼠海马组织中ASK1的表达水平明显升高,有明显的统计学差异(P<0.01);与模型组相比,逍遥散组和氟西汀组小鼠海马内ASK1含量有所降低,有统计学差异(P<0.05)。与正常组相比,模型组小鼠海马组织中MKK4的含量明显升高,具有显著的统计学差异(P<0.01);与模型组相比,逍遥散组和氟西汀组小鼠海马中MKK4的含量显著下降,具有明显的统计学差异(P<0.01)。与正常组相比,模型组小鼠海马组织中MKK7的含量明显升高,具有明显的统计学差异(P<0.01);与模型组相比,逍遥散组小鼠海马中MKK7的含量有所下降,但是并没有表现出统计学差异(P>0.05),而氟西汀组小鼠海马中MKK7的含量降低明显,具有显著的统计学差异(P<0.01)。五、主要结论(1)通过对实验小鼠的宏观表征观察和行为学结果提示,6周的慢性不可预知温和刺激应激造模方法可以成功有效制备小鼠肝郁脾虚证候模型,并且逍遥散可以改善模型小鼠的行为变化,有效降低其抑郁行为。(2)基于ASK1-MKK4/7-JNK信号通路,肝郁脾虚证候模型小鼠海马整体匀浆中ASK1、MKK4、MKK7、JNKmRNA表达含量要明显高于其他三组,并且模型小鼠海马中ASK 1、MKK4、MKK7、JNK、p-JNK的蛋白表达含量也明显高于其他三组,这提示肝郁脾虚证候模型的生物学机制可能与ASK1-MKK4/7-JNK信号通路的激活相关联。(3)基于ASK1-MKK4/7-JNK信号通路,逍遥散可以从基因和蛋白水平对信号通路中关键效应分子进行调控,使其表达下调,这可能是逍遥散防治肝郁脾虚证的生物学基础之一,ASK1-MKK4/7-JNK是其作用依赖的信号通路。(4)逍遥散对模型小鼠的神经细胞具有一定的保护作用。作用途径为:一、逍遥散可以有效抑制模型小鼠海马内JNK信号通路的活性,显著降低JNK的磷酸化水平,从而抑制神经细胞的凋亡。二、逍遥散可以有效抑制caspase依赖的细胞凋亡,显著降低模型小鼠海马中caspase-9基因的表达,进而发挥对神经元的保护作用。