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目的初步研究胰岛素对HepG2细胞GPI-PLD基因表达和GPI-PLD酶活性的影响,以及对细胞膜上GPI锚定蛋白质如CEA分子的释放改变,这些效应是否能够提高淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)杀伤HepG2细胞和GPI-PLD基因转染HepG2细胞的敏感性。方法用阳离子聚合物将本室已经构建的真核表达载体pcDNA3.1 (+)/GPI-PLD转入HepG2细胞,以未转染的HepG2细胞组、阳离子聚合物处理组以及转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞组为对照,G418筛选出阳性细胞克隆。RT-PCR法鉴定GPI-PLD基因的mRNA表达水平,利用自制具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)做底物,定量检测GPI-PLD酶活性。利用胰岛素分别诱导HepG2细胞以及稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞48h,RT-PCR检测各组细胞GPI-PLD基因的mRNA表达水平；利用自制具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)做底物,定量检测GPI-PLD酶活性；ELISA检测各组细胞CEA的释放情况；流式细胞术检测细胞表面GPI锚定的CEA分子的变化。IL-2诱导从正常人外周血分离的外周血单个核细胞。高倍镜下观察LAK细胞与各组HepG2细胞按20：1的效靶比共育12h后的情况,MTT法检测LAK细胞对各组细胞的杀伤效应。结果RT-PCR分析和GPI-PLD酶活性测定表明,稳定高表达GPI-PLD的HepG2细胞系已经建立。胰岛素(10-6mol／L)诱导HepG2细胞以及稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞48h后：1.RT-PCR测定表明诱导后,HepG2细胞组GPI-PLD基因的mRNA表达水平明显高于诱导前细胞的表达水平,统计具有显著性差异(P<0.01),而稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞诱导前后GPI-PLD基因的mRNA表达水平增高不明显；2.诱导后HepG2细胞组细胞的GPI-PLD酶活性明显高于诱导前细胞的酶活性,统计具有显著性差异(P<0.01),而稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞诱导前后GPI-PLD酶活性增高不明显；3.诱导后HepG2细胞释放的CEA分子和诱导前相比明显增多,并且,膜上GPI锚定的CEA分子比诱导前细胞减少,差异具有统计学意义(P<0.01),而稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞诱导后释放的CEA分子增加不明显,而诱导后膜上GPI锚定的CEA分子比诱导前细胞减少,统计具有显著性差异(P<0.01)。LAK细胞与各组HepG2细胞按20：1的效靶比共育12h后,HepG2细胞组和诱导HepG2细胞组、稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞组以及诱导稳定转染GPI-PLD基因的HepG2细胞组相比,靶细胞周围的LAK细胞相对减少,形成的细胞团块也不明显。MTT法检测显示,LAK细胞对诱导后HepG2细胞的杀伤活性和诱导前细胞相比,杀伤活性增加,统计具有显著性差异(P<0.01),而胰岛素诱导转染组杀伤活性和诱导前转染组相比,杀伤活性也有增加,统计具有差异(P<0.05)。结论1.建立了稳定表达GPI-PLD的HepG2细胞株。2.胰岛素能够诱导HepG2细胞GPI-PLD基因过表达,GPI-PLD活性增加。同时,细胞膜上GPI锚定的CEA减少,从而增加LAK细胞杀伤HepG2细胞的敏感性。