【摘 要】
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研究背景:结直肠癌的发生发展机制目前尚不清楚。研究发现,肿瘤细胞物质代谢和相关酶学的改变在肿瘤的发生发展中发挥着重要的促进作用。近年来的研究发现,糖原代谢是肿瘤细胞的一种普遍的物质代谢途径,而调控糖原分解代谢的糖原磷酸化酶（GP）,尤其是肝型糖原磷酸化酶（PYGL）的异常表达,可能与肿瘤的进展有关。既往的研究已发现,结直肠癌组织中的糖原含量与其肿瘤体积及细胞增殖率呈负相关,即结直肠癌组织内糖原水平
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研究背景:结直肠癌的发生发展机制目前尚不清楚。研究发现,肿瘤细胞物质代谢和相关酶学的改变在肿瘤的发生发展中发挥着重要的促进作用。近年来的研究发现,糖原代谢是肿瘤细胞的一种普遍的物质代谢途径,而调控糖原分解代谢的糖原磷酸化酶（GP）,尤其是肝型糖原磷酸化酶（PYGL）的异常表达,可能与肿瘤的进展有关。既往的研究已发现,结直肠癌组织中的糖原含量与其肿瘤体积及细胞增殖率呈负相关,即结直肠癌组织内糖原水平越高,肿瘤体积越小,肿瘤细胞增殖率越低。这提示结直肠癌细胞可通过分解利用糖原来促进其恶性增殖。但是,目前对于调控糖原分解的关键酶GP,尤其是PYGL,在结直肠癌中的表达以及其对结直肠癌糖原代谢和肿瘤发生发展的影响尚不十分清楚。目的:检测结直肠癌组织PYGL及其同工酶脑型糖原磷酸化酶（PYGB）的表达情况,分析PYGL和PYGB的差异性表达与结直肠癌临床病理特征以及预后的关系,明确PYGL在结直肠癌发生发展中的关键作用;研究PYGL在不同的结肠癌细胞株中的表达情况,探讨PYGL表达对结肠癌细胞内糖原代谢水平的调控作用;研究PYGL的表达对结肠癌细胞增殖、迁移能力的影响。方法:①纳入解放军总医院从2009年1月至2010年6月行手术治疗的结直肠癌患者的肿瘤组织110例,取对应的癌旁组织作为对照。采用免疫组织化学的方法检测PYGL和PYGB在癌组织及癌旁组织中的表达差异。②采用WB的方法检测结肠癌细胞株和正常结肠细胞系中PYGL的表达情况。设计三组PYGL-siRNAs（siRNA-1281、siRNA-343、siRNA-640）沉默HCT116 细胞,用 WB 筛选出沉默效率最高的片段,并作为靶基因构建慢病毒载体,包装慢病毒,感染HCT116细胞株并筛选稳转细胞系。③用酶联比色法检测细胞内糖原水平,流式细胞仪检测细胞活性氧（ROS）水平,并分别用MTT法和Transwell法检测细胞增殖和迁移能力。结果:①PYGL和PYGB在结直肠癌组织中的表达率均显著高于其在癌旁组织中的表达率（P<0.01）,PYGL的表达与结直肠癌的淋巴结转移及OS有关,有淋巴结转移的病人PYGL的阳性表达率较高（P<0.01）,COX单因素和多因素分析均显示PYGL表达阳性的患者OS较短（P<0.01）;PYGB在分化程度好的结直肠癌组织中的表达率显著高于其在分化程度差的癌组织中的表达率（P<0.01）,PYGB的表达与淋巴结转移和OS无关（P>0.05）。这提示PYGL可能在结直肠癌的发生发展中起关键作用。②PYGL在结肠癌细胞株HCT116、SW480、CaC02均有表达,而在正常结肠细胞株NCM46不表达。筛选出沉默效率最高的siRNA-640作为靶基因序列,用于构建慢病毒载体,WB检测shRNA可有效下调HCT116细胞中PYGL表达水平。③实验组HCT116细胞（shPYGL）与空载组（shCtr）和空白对照组比较,其细胞内糖原水平（32.6±4.7 vs 14.9±1.7vs 12.7±0.73ng/ul,P<0.01）和 ROS 水平（DCF 荧光相对强度:45.7±4.1 vs 11.8±3.3 vs 3.9±1.0,P<0.01）,均明显上升。shPYGL 组细胞在第 2（0.35±0.02 vs 0.57±0.01 vs0.54±0.02,P<0.01）,3（0.41±0.01 vs0.75±0.04 vs 0.75±0.05,P<0.01）,4（0.50±0.04vs0.86±0.02vs0.86±0.03,P<0.01）天的吸光度（od）值,及穿过 transwell 膜的数目（37.00±5.29 vs 96.67士11.55 vs 103.33±7.02,P<0.01）,与shCtr组和空白对照组比较,均明显降低,提示抑制PYGL,可抑制结肠癌细胞的增殖和迁移能力。结论:结直肠癌癌组织中PYGL表达水平上调,PYGL的表达水平上调与淋巴结转移及患者预后差相关;PYGL的高表达能够有效促进结肠癌细胞对糖原的利用,并降低结肠癌细胞内活性氧水平;PYGL通过动员糖原分解,促进了结肠癌细胞的生长和增殖,提高了结肠癌细胞的迁移能力,可能与结直肠癌的发生与转移机制有关。
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