[背景]骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降,骨微结构破坏,造成骨骼脆性增加,从而容易发生骨质疏松骨折(Osteoporotic fracture,OPF)的全身性骨病。OPF是OP的一个主要并发症,每五分之一的男性和每一位50岁以上的女性都会承受着OPF的风险。治疗OP的药物大致分为两大类:一类是通过抑制破骨细胞活性来减少骨再吸收的药物,代表药物为双磷酸盐(Diphosphonate);另一类是通过增强成骨细胞活性来促进骨形成的药物,代表药物为甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)及其类似物。目前使用的这两类OP治疗药物,无论是抗骨再吸收药物还是促骨形成药物,都存在局限性。恒古骨伤愈合剂(Osteoking)作为云南彝族传统复方中药,在骨疾病的治疗方面使用多年。临床使用中,Osteoking对腰椎间盘突出的治疗具有积极作用。课题组前期研究显示,在家兔股骨头坏死模型中,Osteoking通过增强内源性血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、核心结合因子 α 1(Core binding factor α1,Cbfα1)和骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,Bmp-2)的表达,治疗股骨头坏死。有研究发现在家兔OP模型中,Osteoking通过降低Dickkopf-1基因的表达,提高骨密度。在树鼩OP模型中,Osteoking 通过增强磷酯酰醇3激酶(Phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(Protein kinase B,Akt)/糖原合成酶激酶-3β(Glycogensynthesis kinase-3β,GSK-3β)、骨形态发生蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7,Bmp-7)和(β-连环蛋白(β-catenin)表达,提高骨密度;Osteoking增强Smads蛋白的表达,促进树鼩成骨细胞的增殖。Osteoking属于传统复方中药,传统复方中药的研究现在有了新的方法。网络药理学(Network pharmacology)分析提供中药复方主要成分及其所对应的靶点。蛋白质组学(Proteomics)简化了中药复方的研究,通过蛋白质组学分析获得药物作用于疾病模型后差异表达的相关靶点。生物信息学(Bioinformatics)对网络药理学和蛋白质组学的结果进行再分析,可以获得Osteoking促进OP/OPF骨形成潜在靶点的基因名称、分子功能、所处的细胞位置、生物功能、富集的信号通路等。[目的]研究Osteoking促进OPF大鼠骨形成的分子机制。基于网络药理学挖掘Osteoking的主要成分及其所对应的靶点和基于蛋白质组学挖掘Osteoking促进OPF骨形成的潜在靶点,进一步实验验证Osteoking促进OPF大鼠骨形成的分子机制,为Osteoking防治OP/OPF提供理论依据。[方法]1.Osteoking对OPF大鼠的影响:(1)复制OPF大鼠模型,设置模型对照组(灌胃给予0.59 ml/kg/2d 0.9%生理盐水)、阳性药物对照组(皮下注射0.33μg/kg/2d rhPTH 1-34;人重组甲状旁腺激素1-34,Recombinant human parathyroid hormone 1-34,rhPTH 1-34)、Osteoking 组(灌胃给予0.59 ml/kg/2d Osteoking)。将54只复制成功的OPF大鼠,随机平均分到三个组,每组18只。OPF大鼠模型的药物使用剂量根据临床药物使用剂量、人-大鼠药物剂量折算系数和人-大鼠药物剂量误差系数换算。(2)结合临床药物治疗周期,分别于给药后4周、8周、12周三个时间点进行如下检测分析:①称重。②采用双能X线骨密度仪测量骨密度和骨矿盐含量。③采用诊断性X线仪观察OPF大鼠断端骨痂愈合情况。(3)于给药后4周、8周、12周,每个时间点、每组随机选取6只OPF大鼠,处死动物,取血清。采用ELISA方法分别测定血清骨形成标志物骨碱性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase,BALP)、Ⅰ型前胶原 N 端前肽(Pro-collagen I N-terminal peptide,PINP)和骨吸收标志物抗酒石酸酸性磷酸酶5β(Tartrate-resistant acid phosphatase 5β,TRACP-5β)、Ⅱ 型胶原 C 端肽(C-telopeptide of type Ⅱ collagen,CTX-Ⅱ)的含量。(4)于给药后12周进行如下检测分析:①采用计算机断层扫描X线(Micro-CT)测量右侧股骨,分析骨体积分数、骨表面积/体积比、骨小梁数目、骨小梁厚度、骨小梁分离度、结构模型指数;采用高电压计算机断层扫描X线(High voltage Micro-CT)测量右侧股骨骨折断端愈伤组织含量,并以灰度值表示。②第三腰椎脱钙后,采用苏木精·伊红(HE)染色,显微镜下观察骨小梁结构。③第三腰椎脱钙后,采用茜素红染色,显微镜下观察骨小梁矿化情况,结果采用Image J软件分析。④第三腰椎脱钙后,采用免疫组织化学方法,显微镜下观察目的基因表达情况,结果采用Image J软件分析。2.采用网络药理学方法,分析Osteoking的主要成分并获得主要成分的相关靶点;GEO(Gene expression omnibus)数据库获得 OP 疾病相关靶点;Cyto Scape软件分析、获得Osteoking主要成分的相关靶点和OP疾病相关靶点的交集并可视化;获得Osteoking促进OPF骨形成的潜在靶点。3.于给药12周后,取模型对照组和Osteoking组右侧股骨头,行蛋白质组学检测,并使用生物信息学方法 GO(Gene oncology)、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析结果;获得Osteoking作用于OPF大鼠,差异表达蛋白的分子功能、所处位置、生物功能和富集的信号通路等。4.String数据库分析Osteoking促进OPF大鼠骨形成的潜在靶点,获得Osteoking促进OPF大鼠骨形成潜在靶点的相关靶点。5.分离并培养大鼠骨髓间充质干细胞(Rat bone mesenchymal stem cell,rBMSC),设置对照组、抑制剂组(Osteoking潜在靶点抑制剂)、Osteoking组和Osteoking+抑制剂组。诱导4周后,行茜素红染色,观察rBMSC向成骨细胞分化的钙盐沉着情况;酶标仪测量茜素红染色光密度值(Optical density,OD),吸光度为560 nm。6.实时荧光定量聚合酶链反应(Real time-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和免疫蛋白印迹方法(Western Blotting,WB)验证潜在靶点mRNA及其蛋白的表达情况。[结果]1.Osteoking提高OPF大鼠骨密度,促进OPF大鼠骨折愈合:(1)给药12周后,各组大鼠体重降序排列为阳性药物对照组>Osteoking组>模型对照组,组间比较均具有统计学差异(P<0.05)。(2)给药后第4周到第12周,Osteoking组骨密度逐渐增加;给药12周后,与模型对照组比较,Osteoking组骨密度、骨矿盐含量分别增加(4.5±1.06)%、(20.6±23.67)%(P<0.05);但均低于阳性药物对照组。(3)给药8周、12周后,与模型对照组比较,Osteoking组X线OPF断端表现较好的骨痂愈合线:给药8周后,阳性药物对照组出现骨痂愈合线:给药12周后,Osteoking组出现骨痂愈合线,较阳性药物对照组出现晚,较模型对照组出现早。(4)给药后第4周到第12周,Osteoking组血清BALP增高(49.6±6.13)%、PINP降低(80.6±3.26)%(P<0.05);给药 12 周后,Osteoking 组血清 BALP 和 PINP 含量均高于阳性药物对照组和模型对照组(P<0.05);给药12周后,Osteoking组血清骨吸收标志物TRACP-5β及CTX-Ⅱ无法测量,其血清含量低于ELISA检测灵敏度范围(<0.078ng/ml)。(5)给药12周后,与模型对照组比较,Osteoking组骨体积/表面积比值、骨小梁厚度和骨小梁数目明显增加(P<0.05);但均低于阳性药物对照组(P<0.05)。高电压Micro-CT结果显示,与模型对照组比较,Osteoking组愈伤组织灰度值增高(P<0.05);且与阳性药物对照组愈伤组织灰度值接近(P>0.05)。(6)给药12周后,苏木精-伊红染色显示,与模型对照组比较,Osteoking组的骨小梁结构数量较多;茜素红染色显示,与模型对照组比较,Osteoking组骨小梁的钙盐沉着增多(P<0.05)。但Osteoking组骨小梁结构数量和钙盐沉着数量均低于阳性药物对照组。2.网络药理学结果显示:(1)Osteoking由7种天然植物组成,共获得874个有效成分。根据口服生物利用度(Oral bio-availability,OB)≧30%和药物相似性(Drug-likeness,DL)≧ 0.18,共筛选到129个主要成分。(2)网络药理学方法对129个主要成分进行分析,获得Osteoking主要成分对应的1056个基因靶点,删除重复项获得119个相关靶点。(3)GO注释显示,Osteoking主要成分的相关靶点集中在神经组织的交互、细胞对药物的反应、对有毒物质的反应、参与突触信号转导、对铵离子的反应和参与体内离子平衡等。(4)GEO数据库的基因芯片进行二次挖掘、分析,基于GSE35955、GSE35958、GSE35959数据芯片,获得665个与OP发生、发展密切相关的已知靶点。(5)利用Cyto Scape软件所构建的“成分-靶点-疾病”可视化交互网络图,通过网络拓扑分析共筛选出Osteoking与OP相关的3个关键靶点:γ-氨基丁酸受体亚基α2(Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-2,GABRA2)、尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase-type plasminogen activator,PLAU)和热休克蛋白90-AB1(Heat shock protein-beta,Hsp 90-β)。3.蛋白质组学结果显示:(1)Osteoking给药OPF大鼠12周后,蛋白质组学分析结果显示,显著差异表达的蛋白中,上调的蛋白数量有7个,包括Hsp 90-β、脂肪酸结合蛋白(Fatty acid-binding protein)等;下调的蛋白数量有14个,包括基质γ-竣基谷氨酸蛋白(Matrix gla protein,Mgp)、脂质结合蛋白(Adipocyte lipid-binding protein)等。此外,1型/2型角蛋白(Keratin,type Ⅰ/Ⅱ)的表达有上调,也有下调。(2)GO注释结果显示,Osteoking差异表达蛋白的生理作用包括参与生物机体调节、对外界刺激的应激以及组织生理病理过程等;作用位置集中在细胞外基质;主要功能是结合分子物质、调节分子功能、参与分子结构活动和催化作用等。(3)KEGG分析Osteoking差异表达蛋白的信号通路富集结果显示,Osteoking与OPF骨形成相关的分子机制为转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路。4.Hsp 90-β和Mgp是Osteoking促进OPF大鼠骨形成的关键靶点:(1)体内实验,Osteoking给药12周后,OPF大鼠RT-qPCR和WB结果显示,与模型对照组比较,Osteoking组骨组织Hsp 90-β表达增强(P<0.05);体外实验,Osteoking诱导rBMSC 4周后,RT-qPCR和WB结果显示,与对照组比较,Osteoking 组 Hsp 90-β表达增强(P<0.05)。(2)Hsp 90-β抑制剂诱导rBMSC 4周后,茜素红染色结果显示,与对照组和Hsp 90-β抑制剂组比较,Osteoking组的钙盐沉着增多(P<0.05);与Osteoking组比较,Osteoking+Hsp 90-β抑制剂组钙盐沉着减少(P<0.05);与对照组和Hsp 90-β抑制剂组比较,Osteoking+Hsp 90-β抑制剂组钙盐沉着增多(P<0.05)。(3)String数据库分析显示,Osteoking作用靶点Mgp,调控的相关基因包括Bmp-2、骨γ-羧基氨基甲酸酯(Gla)蛋白(Bone gamma-carboxyglutamate protein,Bglap)和富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(Secreted protein acidic and rich in cysteine,Sparc)。(4)Osteoking给药12周后,OPF大鼠RT-qPCR和WB结果显示,与模型对照组比较,Osteoking 组骨组织 Mgp 表达下降(P<0.05),TGF-β、Bmp-2、Bglap 和Sparc 表达升高(P<0.05)。[结论]1.Osteoking提高OPF大鼠骨密度,改善骨微结构;促进OPF大鼠骨折愈合。2.Osteoking 与 OP 相关的潜在靶点是:GABRA2、PLAU、Hsp 90-β。3.Osteoking促进OPF大鼠骨形成的分子机制主要在TGF-β信号通路。4.Osteoking通过增强Hsp 90-β的表达、抑制Mgp的表达,促进OPF大鼠骨形成。