论文部分内容阅读
背景:延髓头端腹内侧区(Rostral Ventromedial Medulla,RVM)是中枢痛觉下行调节系统的最后一个核团,被认为是疼痛调控的“闸门”。当外周出现疼痛刺激时,RVM这一“闸门”中存在放电活动立刻显著增加的“开”神经元(ON细胞)和放电活动立刻显著减少的“关”神经元(OFF细胞)。但这些能对疼痛刺激产生特异性放电变化,与疼痛关系如此密切的ON和OFF细胞,究竟对疼痛发挥怎样的作用仍是未解之谜。解开这一谜团有助于探索疼痛机制,寻找疼痛治疗的可能靶点。目的:探究特异性调控ON细胞对急慢性疼痛的影响并初步探索其所接受上行投射的神经环路。方法:本研究分为三个部分:1)使用CPRSPR-Cas9技术构建Gper1-Cre小鼠并通过短片段PCR联合琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型;采用含白喉毒素片段A(Diphtheria Toxin A-chain,DTA)病毒或光遗传激活病毒分别特异性毁损或激活ON细胞,通过热板、福尔马林实验和结直肠充胀(Colorectal Distention,CRD)等行为学实验探讨对生理痛阈和完全弗式佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)所致慢性外周炎性疼痛及葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)所致慢性内脏疼痛的影响。2)采用顺行和逆行病毒示踪探究脊髓神经元与RVM区ON细胞之间的投射关系;通过免疫荧光染色判断此类脊髓神经元的性质;使用化学遗传和DTA病毒对其进行调控以探讨对疼痛的作用。3)使用双光子和活体钙成像观察RVM区ON细胞在疼痛刺激和光遗传激活脊髓神经元时的活动变化,以探究脊髓神经元是否可直接激活ON细胞。结果:1)成功构建并获得Gper1-Cre纯合子小鼠;毁损RVM区ON细胞可提高慢性炎性痛、热痛和内脏痛阈值;激活ON细胞可易化慢性疼痛。2)脊髓中存在一类可直接上行投射至RVM区ON细胞的神经元(Spinal Neurons Ascending Projection to RVM,SNAPR);SNAPR为一类兴奋性神经元;抑制SNAPR可减轻CFA所致的机械性痛觉过敏。3)光遗传激活SNAPR和外周疼痛刺激均可使ON细胞放电活动增加。结论:脊髓SNAPR神经元可上行投射至RVM区ON细胞,毁损ON细胞可通过抑制下行易化系统减轻慢性外周和内脏疼痛的严重程度。“脊髓-RVM-脊髓”的新疼痛调节神经环路可能是急性疼痛慢性化及慢性疼痛复杂性的原因之一。