目前研究倾向认为猪瘟病毒(CSFV)非结构蛋白NS3是致细胞病变作用(CPE)的关键,细胞内NS3蛋白的量与细胞出现CPE之间存在着相关性。利用PK-15细胞系表达非结构蛋白NS3来研究CSFV致细胞病变的机理,既有利于进一步认识CSFV与宿主细胞的相互关系,又对于揭示猪瘟病毒致病的分子机理有着重要意义。病毒感染细胞后在胞内的增殖是研究病毒致病机理的基础,CSFV 5’-UTR和3’-UTR是复制和表达的主要调节区,在病毒基因组复制和聚蛋白翻译过程中起着重要的作用。利用RNAi技术以3’-UTR为靶目标抑制CSFV增殖,可为研究CSFV致病机理提供科学资料。1.参考发表的猪瘟病毒Shimen株NS3基因序列,设计1对5’端分别引入Xho I和Kpn I酶切位点的引物,RT-PCR扩增猪瘟病毒Shimen株NS3基因。PCR产物连接克隆载体测序鉴定后,经Xho I和Kpn I双酶切回收到NS3基因,并亚克隆到真核表达载体pEGPF-C1,再经Xho I和Kpn I双酶切鉴定后用QIAGENE Plasmid Mini Kit纯化,获得了纯度较高的重组表达质粒pEGFP-NS3,质粒浓度为0.6μg/μL。2.利用Lipofectamine 2000 Regent转染pEGFP-NS3和pEGFP-C1质粒于PK-15细胞中,由最佳G418浓度抗性筛选12 d后分别得到转染pEGFP-NS3与pEGFP-C1的阳性细胞。SDS-PAGE和Western blot检测阳性细胞表明,PK-15细胞表达的NS3蛋白大小约68 ku;显微镜观察发现,转染pEGFP-NS3的PK-15阳性细胞在传代72 h后出现细胞变圆、脱落细胞增多的CPE现象。3.应用Tunel方法检测转染pEGFP-NS3与pEGFP-C1的阳性细胞在传代72 h后的凋亡情况。结果表明,转染pEGFP-NS3的阳性细胞出现凋亡,并产生CPE,且凋亡现象与细胞内的NS3蛋白表达量有关。凋亡计数表明,每1 000个细胞,转染pEGFP-NS3与pEGFP-C1的阳性细胞凋亡率分别为43.4 %和13.1 %,两者差异显著(P<0.05)。4.针对猪瘟病毒Shimen株3’-UTR,设计合成3对分别靶向3’-UTR 114～132位、136～154位和209～227位的编码短发夹RNA(shRNA)序列的DNA单链;将其与干扰载体pGenesil-1连接并测序鉴定了3个构建的重组干扰表达载体pGene-1、pGene-2和pGene-3。将纯化后的干扰载体转染PK-15细胞,由最佳G418浓度抗性筛选12d后获得阳性细胞,再通过两轮有限稀释法得到了3株能持久转录分别靶向3’-UTR 114～132位、136～154位和209～227位核苷酸序列shRNA的PK-15细胞株。