研究背景与目的食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是一种侵袭性疾病,在遍布恶性肿瘤的全球中食管鳞癌的发病率排名第七,死亡率排名第六。最高的发病率出现在南部和东部非洲以及中亚。食管癌包括两种亚型:鳞癌和腺癌,90%的食管局部恶性肿瘤都为食管鳞状细胞癌（ESCC）。对于局部晚期ESCC患者,术前放化疗可提高病理完全缓解率并提高生存率,但其五年生存率仍低于30%。早发现和早治疗是我们研究食管癌的初衷。最初的观察性研究发现生活方式因素,如饮食、吸烟和肥胖与ESCC风险增加有关。随后的研究发展从分子水平上解释促进食管鳞癌发生发展的机制,以此改进ESCC的诊断和治疗方案。染色体维持蛋白 6（Minichromosome Maintenance 6,MCM6）是 DNA 复制起始和延伸的关键调控因子,有文献报道MCM6可以调节MEK/ERK等下游信号,从而促进致癌。MEK/ERK（Mitoge-activated protein kinase kinase/Extracellular signal-regulated kinases）信号途径是丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK）家族成员中的重要调控通路之一,主要调控细胞发育成长、发生发展和细胞分裂增殖。研究显示,MEK/ERK通路参与众多人类疾病,特别是在肿瘤中更为突出,有文献报道该通路可以促进肿瘤细胞增殖迁移和上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymaltransition,EMT）的发生。然而,MCM6是否在ESCC中发挥同样的促癌作用,以及它是否能够通过MEK/ERK通路调节EMT的发生进而调控食管鳞癌的侵袭迁移尚且未知。本课题组前期是通过生信分析方法筛选出在食管鳞癌中高表达的基因MCM6,并通过免疫组化进行了验证。本次研究将继续从细胞层面出发,通过干预相关基因的表达,观察食管鳞癌细胞生长迁移能力,进而探索其与MEK/ERK通路和EMT发生之间的相互关系,讨论促进食管鳞癌发生发展、高发病率和高死亡率的原因,为未来食管鳞癌的标准化治疗和精准治疗提供可研究的方向。研究内容与方法1.本研究通过质粒脂质体转染ESCC细胞,构建MCM6过表达细胞模型,并利用逆转录实时荧光定量PCR技术和Western blot蛋白检测方法进行转染后的效率验证;2.在构建MCM6过表达细胞模型的前提下进行体外实验,我们通过CCK8实验检测细胞前后生长增殖情况的变化;采用细胞划痕愈合实验、Transwell实验分析细胞处理后的愈合修复能力以及食管鳞癌细胞从上室到下室迁移转移能力的强度变化;通过流式细胞仪器检测分析过表达MCM6对细胞凋亡和细胞周期的影响;3.通过实时荧光定量PCR、Western blot蛋白检测方法检测上皮细胞-间充质转化（EMT）相关信号蛋白指标检测。同时利用课题组之前通过siRNA敲低MCM6构建的细胞模型进行细胞免疫荧光染色技术检测,从另一角度检测EMT相关蛋白表达水平;4.采用实时荧光定量PCR、Western blot蛋白检测方法对MEK/ERK通路的相关蛋白进行检测,借此分析过表达MCM6促进食管鳞癌侵袭转移的分子机制。研究结果1.体外实验显示,过表达MCM6后,食管鳞癌细胞增殖、愈合和迁移能力增强;2.实时荧光定量PCR、Western blot检测结果显示,过表达MCM6后,食管鳞癌细胞中MEK/ERK信号通路中的关键分子MEK、ERK及其磷酸化分子表达量增高;上皮细胞间充质转化中Ecadherin表达量降低,Ncadherin、Vimentin表达量增多;敲低MCM6后,免疫荧光实验结果显示Ecadherin表达量增多,Ncadherin、Vimentin 表达量降低。研究结论结合课题组之前的研究和目前的研究结果,我们发现MCM6基因确实在食管鳞癌的发生发展过程中发挥了极大的促癌作用,其高表达会大大提升食管鳞癌细胞的增殖迁移能力,同时发现MCM6亦可通过MEK/ERK通路诱导食管鳞癌细胞发生EMT改变,食管鳞癌侵袭转移能力大大加强,这为探讨食管鳞癌的侵袭迁移机制提供了一个新的研究方向,有望临床针对MEK/ERK通路中的相关蛋白变化及其上下游调节关系研发新的治疗靶点。