目的：　　乙型肝炎病毒是以逆转录方式进行复制的嗜肝 DNA病毒。SAMHD1(SAM domain and HD domain-containing protein1)是一种细胞内重要的天然免疫因子，能够抑制逆转录病毒和 DNA病毒的复制，主要通过降解病毒复制需要的dNTP原料来有效抑制病毒的复制；同时SAMHD1的磷酸化负调控其抗病毒作用。尽管之前有报道SAMHD1在肝癌细胞中抑制HBV复制，但没有阐明SAMHD1磷酸化是否与限制 HBV复制相关，同时尚不清楚宿主的蛋白激酶如何参与调控SAMHD1的磷酸化。因此本文主要研究了宿主限制性因子SAMHD1和乙肝病毒的相互作用：一方面，鉴定了 SAMHD1作为干扰素诱导基因，在细胞核内抑制HBV复制，其抑制作用依赖于其脱氧核苷三磷酸水解酶（dNTPase）活性；另一方面，阐明 SAMHD1磷酸化与其抗病毒作用的关系，进一步在肝细胞中筛选和鉴定了细胞周期激酶CDK2参与调控了SAMHD1的磷酸化及病毒复制，并通过CO-IP等方法证实了在肝细胞中CDK2直接作用于SAMHD1的分子机制。研究结果有助于阐明宿主宿主限制性因子SAMHD1的抗病毒机制及HBV募集细胞周期激酶CDK2磷酸化SAMHD1，拮抗其抗病毒的机制，并为CDK2-SAMHD1作为新的抗病毒靶点筛选新的治疗HBV的药物奠定基础。　　方法：　　分为两部分。第一部分：SAMHD1抑制HBV复制的机制研究(1)检测在肝细胞中 SAMHD1为干扰素诱导基因，通过干扰素(α、β、γ)处理细胞后，分别提取细胞总RNA及总蛋白，通过qPCR,Western blot检测干扰素对SAMHD1的RNA水平及蛋白的作用；(2)在HBV转染复制模型Huh7.0细胞中通过过表达外源性的SAMHD1质粒或干扰内源性的SAMHD1，通过Southern blot检测过表达外源性 SAMHD1或敲低内源性 SAMHD1对病毒复制的影响；(3)研究SAMHD1抑制病毒复制依赖于其核酸水解酶活性：应用定点突变构建了SAMHD1的dNTPase活性位点(D207N)、RNA酶活性位点(Q548A)及核定位信号活性位点(D11-14)的突变体，在HBV转染复制模型上通过Southern blot检测SAMHD1不同位点突变后对病毒复制的影响及ELISA检测了上清分泌的HBsAg变化情况；通过免疫荧光研究 SAMHD1在肝细胞中的定位及其抗病毒作用是否依赖于其核定位。第二部分：研究细胞周期激酶 CDK2磷酸化调控 SAMHD1，拮抗其抑制HBV复制的分子机制：(1)研究了 SAMHD1磷酸化对其抗病毒作用的影响：构建了SAMHD1不同的磷酸化位点突变体，在肝癌细胞Huh7.0中通过Southern blot检测了这些磷酸化突变位点对HBV复制的影响；(2)在肝细胞中筛选CDK2激酶参与了调控SAMHD1磷酸化和病毒复制：在肝细胞中，通过siRNA敲低细胞周期蛋白关键激酶CDK1、CDK2、CDK6后，Western blot检测对SAMHD1的磷酸化水平的影响，Southern blot检测其对HBV复制的影响，流式细胞术检测了其对细胞周期的影响；接着利用靶向细胞周期激酶的特异性抑制剂(CDK1抑制剂、CDK2抑制剂、CDK6抑制剂)作用肝细胞后，研究了SAMHD1磷酸化水平的变化，病毒复制水平的变化；接着在Huh7.0细胞中通过CO-IP试验研究了SAMHD1与CDK2的相互作用，在293T细胞中通过CO-IP研究了SAMHD1与CDK2、HBV core蛋白之间的相互作用；最后在HBV转染复制细胞模型和HepG2-NTCP感染模型上研究了敲低Cyclin E2对SAMHD1磷酸化及HBV复制的抑制作用。　　结果：　　第一部分，SAMHD1抑制HBV复制的机制研究，在Huh7.0细胞中，加入不同剂量的α、β、γ后分别提取RNA或蛋白，结果表明干扰素α和β处理后，SAMHD1蛋白的转录和翻译水平明显随剂量的增加而增加，而干扰素γ在1000U/ml剂量处理后，SAMHD1的mRNA和蛋白水平有一定的增加，但是没有显著差异，表明SAMHD1主要受到I型干扰素的诱导上调；在Huh7.0细胞中沉默内源性SAMHD1，HBV的复制增强3.5倍，表明SAMHD1具有限制病毒复制的作用，接着通过siRNA沉默内源性SAMHD1的表达后，分析干扰素α、β对HBV的抑制效应的变化，结果表明：与对照组相比，干扰素α处理后，SAMHD1的蛋白水平增加2.16倍，其HBV复制水平降低76%；干扰素β处理后，SAMHD1的蛋白水平增加2.87，其HBV复制水平降低81%；但是干扰内源性SAMHD1后，干扰素α和干扰素β抑制HBV复制的作用明显减弱，表明干扰素α和干扰素β抑制 HBV复制的作用依赖于内源性的限制性因子 SAMHD1。接着我们 Huh7.0和HepAD38细胞中过表达外源性SAMHD1后，MTT检测细胞相对活力表明外源性SAMHD1对细胞没有明显的毒性，同时外源性表达的SAMHD1能够显著抑制HBV的复制。我们通过免疫荧光检测了SAMHD1在Huh7.0的细胞定位：无论是干扰素诱导内源性的SAMHD1还是过表达SAMHD1，均定位在细胞核内，而缺失核定位信号(NLS)的突变蛋白则定位于细胞质中；缺失NLS的SAMHD1突变蛋白D11-14丧失了对HBV的抗病毒作用，表明SAMHD1对HBV的抑制作用依赖于其核定位。　　第二部分：在HBV转染复制模型Huh7.0细胞中，通过共转HBV复制质粒与SAMHD1表达质粒及其dNTPase活性突变、核酸酶突变、及磷酸化位点突变后与对照比较，发现SAMHD1野生型及T592V（去磷酸化突变体）都能抑制HBV的复制，然而，dNTPase活性突变体D207N和D137N及T592E磷酸化丧失了其抑制HBV复制的作用，这说明SAMHD1蛋白dNTPase活性和T592位点的去磷酸化对其抑制HBV复制是至关重要的。核酸酶突变体Q548A/T592V仍然具有抑制HBV复制的作用，表明SAMHD1的核酸酶不是其抗病毒作用相关。同样检测SAMHD1不同磷酸化位点的突变体(S18E,T21E,T25E,S33E,T592E)对病毒复制的作用表明只有T592位点突变成磷酸化形式后，SAMHD1失去了对HBV的抑制作用，而其位点的模拟磷酸化突变S18E,T21E,T25E,S33E和S93E仍然对HBV具有抑制活性，说明SAMHD1的T592磷酸化位点是其拮抗抗病毒活性的重要位点。我们在Huh7.0细胞中，先转染敲低CDK1、CDK2、CDK6的特异性siRNA，然后过表达HBV复制质粒，72小时后，提取细胞内的磷酸化蛋白及HBV的病毒颗粒DNA，结果表明与对照相比，干扰CDK1或CDK6表达后SAMHD1的T592位磷酸化及HBV的复制没有明显的变化；而干扰CDK2表达后，SAMHD1蛋白T592位磷酸化显著下降，同时病毒复制水平显著下降。说明相对于CDK1、CDK6来说，CDK2激酶参与了 SAMHD1的磷酸化和病毒复制的调控作用。其次在Huh7.0细胞中通过加入CDKs(CDK1,CDK2,CDK6)的特异性抑制剂处理后，发现CDK2抑制剂能够有效抑制SAMHD1的磷酸化水平，进而抑制了HBV的复制，而CDK1和CDK6抑制剂对SAMHD1的磷酸化水平及对HBV复制没有明显作用；在Huh7.0细胞中，共转SAMHD1及CDK2，通过Co-IP发现SAMHD1与CDK2存在相互作用；在293T细胞中，通过CO-IP发现SAMHD1与CDK2存在相互作用，但 HBV core蛋白没有参与 SAMHD1/CDK2的活化形式；在转染复制模型Huh7.0和HepG2-NTCP感染模型中，干扰Cyclin E2显著降低了了SAMHD1的磷酸化和病毒复制，表明Cyclin E2参与了CDK2磷酸化SAMHD1的过程。　　结论：　　在肝细胞中，内源性的SAMHD1受干扰素α、β调控发挥其抗病毒作用；SAMHD1抑制HBV复制依赖于其脱氧核苷三磷酸水解酶活性和细胞定位；SAMHD1蛋白T592位点的磷酸化负调控其抗病毒作用；在肝细胞中，CDK2激酶参与了调控 SAMHD1的磷酸化和病毒复制过程， CDK2能够直接作用于SAMHD1；Cyclin E2参与CDK2磷酸化SAMHD1，调控病毒复制的过程。