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活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）是细胞生命活动过程中产生的具有高度氧化活性的副产品。在其水平比较低的时候,ROS是促进细胞增殖和生存的信号分子;当水平升高时,ROS会导致DNA氧化损伤而引起DNA突变和细胞癌变,但有时过高的ROS水平也可以导致细胞内蛋白、脂肪和核酸等大分子的大面积氧化损伤,促使细胞衰老或凋亡。为了避免ROS引发的氧化损伤,细胞内存在多种抗氧化剂分子,可以将活性氧转化为无活性的分子。研究发现,癌细胞相对于正常细胞会有更加明显的氧化压力。为了避免氧化应激带来的伤害,癌细胞会上调多种抗氧化通路的活性来缓解高ROS水平伴随的氧化毒性,使其能维持在高度增殖的状态。因此,与正常细胞相比癌细胞能进一步调动的抗氧化能力的储备会更加有限,对于额外的氧化损伤的触发会异常敏感。升高ROS水平或者抑制细胞的抗氧化能力可选择性地使癌细胞内ROS达到毒性水平,而正常细胞因为ROS输出水平低、抗氧化能力储备高则可以将ROS维持在毒性水平以下。因此抗氧化能力的差异有望成为一个开发新型肿瘤治疗策略的方向。细胞中最重要的抗氧化剂之一是谷胱甘肽（Glutathione,GSH）,因此谷胱甘肽的存在是癌症发生发展所必须的。L-丁硫氨酸-亚砜亚胺（L-Buthionine-（S,R）-sulfoximine,BSO）是谷胱甘肽的特异性抑制剂。在癌细胞形成后用BSO等抑制谷胱甘肽并不能有效地升高细胞内的ROS水平,可能是由于潜在的其它抗氧化通路的存在,使得抑制一条抗氧化途径后,细胞会有其它抗氧化途径进行补救。谷胱甘肽减少时细胞内胱氨酸水平增加,可能会驱动另一种抗氧化途径即硫氧还蛋白途径（Thioredoxin,TRX）进行弥补。土木香内酯（Alantolactone,ATL）是传统中草药土木香的活性物质,研究证实ATL可特异性抑制细胞内硫氧还蛋白还原酶（Thioredoxin reductase）来抑制TRX途径。为此,本研究拟利用BSO和ATL组合同时抑制细胞内两种主要抗氧化途径,以此使细胞内ROS水平升高,并研究升高ROS后对癌细胞和非癌细胞的影响。论文首先探讨了BSO和ATL的抗癌活性及其升高细胞内ROS的能力。用MTT实验计算出BSO以及ATL在乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人骨肉瘤细胞系U2OS中的IC50值。然后,选用三种低于BSO IC50值的浓度作用30 min,检测两种癌细胞系ROS水平。我们发现三种浓度都没有显著升高细胞内ROS的水平。随后,我们组合了亚致死量的40μM的BSO与4μM的ATL同时处理细胞,发现两种癌细胞的ROS水平在30 min内急剧上升,但是单独的低浓度的BSO或ATL都不会显著升高癌细胞内的ROS水平。与此同时,无论是单药还是两药联合处理,非癌细胞系人结肠上皮细胞株NCM460中的ROS水平都没有明显的变化。实验结果表明,亚致死剂量的BSO与ATL联合可以快速地升高癌细胞内ROS水平,而对非癌细胞系的ROS水平没有影响。接下来,我们探讨了升高ROS在癌细胞内产生的影响。实验结果表明40μM的BSO与4μM的ATL处理细胞12 h引起了癌细胞内8-氧鸟嘌呤（8-oxo G）水平的上升,伴随产生了大量DNA链断裂,而加入ROS抑制剂N-acetyl cysteine（NAC）可以消除在癌细胞内引起的上述变化,但是在正常细胞系中不会明显检测到8-oxo G的升高和DNA链断裂。以上结果证明亚致死量的BSO和ATL的联合特异性地在癌细胞中产生很严重的DNA氧化损伤。与此一致,我们发现40μM的BSO与4μM的ATL导致了细胞内DNA损伤反应（DDR）通路中p-Chk1,p-Chk2,p53,p21蛋白的升高,证明了DDR通路的激活。流式细胞术证明了40μM的BSO与4μM的ATL联合引发了显著的G2/M细胞周期检验点的激活。有研究表明抑制抗氧化药物与DDR通路抑制剂联合可以提高肿瘤治疗效果。为此我们进一步探讨了低浓度的抗氧化抑制剂与低浓度的DDR通路抑制剂联合所导致的作用效果。我们依旧选择了低剂量且无细胞毒性的40μM ATL与4μM BSO组合抑制抗氧化途径,在此基础上加入了低浓度的DDR通路中的ATR抑制剂VE822 0.05μM。我们发现ATR抑制剂的加入解除了细胞周期阻滞现象,抑制了DDR通路介导的DNA修复途径,从而产生了更加显著的DNA损伤现象。实验证明了联合所引起的DNA损伤在细胞分裂阶段不断积累而没有被及时修复,使细胞带着损伤的DNA直接进入了有丝分裂阶段,最终导致有丝分裂灾难和细胞崩溃死亡。我们发现在此阶段加入NAC可以抵消两种抗氧化抑制剂产生的DNA损伤效果,并且可以明显地降低抗氧化抑制剂与ATR抑制剂所产生的协同致死毒性。加入OGG1抑制剂O8同样可以消除三种药物联合在癌细胞内产生的细胞毒性,说明了OGG1所介导的碱基切除修复引发的相关DNA断裂是抑制抗氧化通路与抑制DDR联合的基础。综上所述,本论文证明了低剂量、无细胞毒性的抑制抗氧化通路药物BSO和ATL组合可以特异性地引起癌细胞发生DNA氧化损伤,同时证明ATR抑制剂VE822与BSO-ATL组合引起的DNA氧化损伤具有显著协同抗癌效果。这种协同致死作用主要与癌细胞内较高水平的氧化压力和有限的抗氧化能力储备有关。我们的研究对利用癌细胞与正常细胞中代谢水平的差异来设计更加高效、毒副作用低的药物组合提供了新的思路和可能性。